| 研究概要 |
Dorfinの基質となる蛋白質を2つの方法(酵母Two-Hybrid法およびマススペクトロメトリー)によって行った.
2.Dorfinの全長,RING-finger/IBRドメインを含むN末端およびC末端をbaitとして酵母Two-Hybrid法によりDorfinと相互作用する蛋白質の探索を行い,多数の結合蛋白質を同定した.同定された蛋白質の中で,免疫沈降法などにより実際にDorfinと相互作用が確認されたものには,ユビキチン結合酵素(E2),神経特異的転写因子,細胞骨格構成成分などが含まれていた.そのうち,DorfinのN末端に結合する蛋白質として同定された微小管結合蛋白質1B(MAP1B)は,パーキンソン病・Lewy小体性痴呆Lewy小体に出現するLewy小体に局在していることが知られているが,免疫組織学的にMAP1BとDorfinの局在は一致していた.細胞骨格異常は,ALSの病態において重要な役割を果たしていると考えられており,MAP1BとALS病態との関連をさらに検討する必要がある.
3.培養細胞HEK293からFLAGタグ標識Dorfinの結合タンパク質をpull-downし,Dorfinと相互作用する蛋白質をマススペクトロメトリーにより探索した.Dorfin複合体のマススペクトロメトリーよる解析から複数の候補タンパク質を得た。そのうちVCP/p97はin vitroおよびin vivoにてDorfinと結合することが明らかとなった。マウス中枢神経系組織および複数の培養細胞内で,Dorfinは400kD-600kDの複合体を形成しており,複合体内でVCP/p97と結合していることが示唆された。さらに,VCP/p97のドミナントネガティプ変異体は,Dorfinのin vivoでのユビキチンリガーゼ(E3)活性を阻害し,DorfinのE3活性にはVCP/p97が必要であることが明らかとなった.
|
