神経幹細胞への染色体部位特異的遺伝子組込み法の開発

• 研究課題/領域番号: 15659343
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 脳神経外科学
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 岡田 尚已 自治医科大学, 医学部, 講師 (00326828)
• 研究分担者: 小澤 敬也 (小沢 敬也) 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707) ; 卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 講師 (40213516)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円); 2004年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2003年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
• キーワード: アデノ随伴ウイルス / 染色体部位特異的遺伝子組込み / Rep / AAVS1 / 幹細胞 / アデノウイルスベクター / CAR / c-Kit / 染色体遺伝子組込み / アデノウイルス

研究概要

AAVの二つのコンポーネント(ITR配列とRep蛋白質)を利用し、第19番染色体長腕AAVS1領域に遺伝子を組み込ませる方法の応用開発を推進した。これまでにITR配列連結マーカー発現ユニットを構築し、切り出されたstuffer配列中のITRにRepが結合することによって、第19番染色体AAVS1領域に遺伝子組込みが生ずることを検討した。HeLa細胞を用いて、Southern blot解析によるAAVS1領域の遺伝子再構成とマーカー遺伝子のAAVS1領域特異的遺伝子組込み様式を確認した。
さらに、ITR配列連結マーカー発現ユニットとRep発現誘導カセットを有するアデノウイルスベクターの応用を念頭に、アデノウイルスベクターの幹細胞への吸着を仲介するアダプター分子を開発した。アデノウイルスベクターに親和性のあるCARと幹細胞に発現するc-Kitのリガンド分子である幹細胞因子(SCF)を連結した、可溶性融合蛋白質CAR-SCFを構築し、その効果を検討した。CAR陰性c-Kit陽性の細胞株M07eへのeGFP発現Adベクター遺伝子導入(MOI 50)において、CAR-SCFを培養液に添加することでeGFP陽性率は0.5%から78%に向上した。ヒト臍帯血CD34^+細胞を用いた検討でも、9.8±3.7%から17.5±2.5%に改善された。CAR-SCFはc-Kit陽性細胞へのアデノウイルスベクター遺伝子導入効率を向上させ、これを用いた幹細胞へのAAVS1領域特異的遺伝子組込みへの応用が期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Efficient and stable Sendai virus-mediated gene transfer into primate embryonic stem cells with pluripotency preserved. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K., et al.
  • 雑誌名: Gene Ther. 12・3 ページ: 203-210
• [雑誌論文] Separate Control of Rep and Cap Expression Using Mutant and Wild-Type LoxP Sequences and Improved Packaging System for Adeno-Associated Virus Vector Production. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mizukami, H., et al.
  • 雑誌名: Mol Biotechnol. 27・1 ページ: 7-14
• [雑誌論文] Expansion of genetically corrected neutrophils in chronic granulomatous disease mice by cotransferring a therapeutic gene and a selective amplifier gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hara, T., et al.
  • 雑誌名: Gene Ther 11・18 ページ: 1370-1377
• [雑誌論文] Establishment of Cre/LoxP recombination system in transgenic rats. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sato, Y., et al.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 319・4 ページ: 1197-1202
• [雑誌論文] A soluble CAR-SCF fusion protein improves adenoviral vector-mediated gene transfer to c-Kit-positive hematopoietic cells. (2003)
  • 著者名/発表者名: Itoh, A., et al.
  • 雑誌名: J.Gene Med. 5・11 ページ: 929-940
• [雑誌論文] Development of new inbred transgenic strains of rats with LacZ or GFP.
  • 著者名/発表者名: Inoue, H., et al.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. (in press)
• [産業財産権] Agents for adsorption and ridging for adenovirus (2003)
  • 発明者名: Itoh A., et al.
  • 権利者名: 旭化成
  • 出願年月日: 2003-05-15
• [文献書誌] Okada T, et al.: "In situ generation of pseudotyped retroviral progeny by adenovirus-mediated transduction of tumor cells enhances the killing effect of HSV- tk suicide gene therapy in vitro and in vivo"J.Gene Med.. (in press).
• [文献書誌] Itoh A, et al.: "A soluble CAR-SCF fusion protein improves adenoviral vector-mediated gene transfer to c-Kit-positive hematopoietic cells"J.Gene Med.. 5・11. 929-940 (2003)
• [文献書誌] Nomoto T, et al.: "Distinct patterns of gene transfer to gerbil hippocampus with recombinant adeno-associated virus type 2 and 5"Neuroscience Letters. 340. 153-157 (2003)
• [文献書誌] Lu Y Y, et al.: "Intramuscular injection of AAV-GDNF results in sustained expression of transgenic GDNF, and its delivery to spinal motoneurons by retrograde transport"Neurosci Res.. 45・1. 33-40 (2003)
• [文献書誌] Ideno J, et al.: "Persistent phenotypic correction of central diabetes insipidus using adeno-associated virus vector-expressing arginine-vasopressin in brattleboro rats"Mol.Ther.. 8・6. 895-902 (2003)
• [文献書誌] Kume A, et al.: "In vivo expansion of transduced murine hematopoietic cells with a selective amplifier gene"J.Gene Med.. 5・3. 175-181 (2003)