特異的タンパク質ノックダウン法を用いた細胞外基質と骨形成シグナルの相互作用の解析

• 研究課題/領域番号: 15659441
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 機能系基礎歯科学
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 田村 正人 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (30236757)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円); 2004年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円); 2003年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: 骨芽細胞 / 骨形成 / 細胞外基質 / ノックダウン

研究概要

マウス筋芽細胞であるC2C12細胞を培養し本研究に用いた.この細胞にBMP2を加えて培養するとアルカリフォスファターゼ(ALP)活性が増加するとともに,骨芽細胞に特異的なオステオカルシンの発現が誘導され,骨芽細胞へ分化しうる.ノーザンプロット法を用い細胞接着因子のmRNA発現を検討したところ,E-カドヘリンならびにα5 integrinの発現が見られた.カドヘリンの細胞内裏打ちタンパク質であるβ-cateninはLef/Tcf1と結合してDNAに結合し転写調節の機能も有している.そこで,Lef/Tcf1応答領域レポーター(pTOP-FLASH)をC2C12細胞にトランスフェクトした.GSK-3によるリン酸化部位を欠失させた活性型β-cateninもしくはWnt3aを導入すると,pTOP-FLASHの活性は増大した.他方,non-canonical WntであるWnt-5aによっては,その活性は増加しなかった.Wnt3aと同時にBMP2を添加したところ,その活性は低下した.これらの結果から,C2C12細胞においてもWntのcanonical経路が存在しBMP2はこれに抑制的に機能することがわかった.RNAiを用いたノックダウンを行うために,α5 integrin等のインテグリンやGSK3βの一部のmRNA配列相当の合成ヌクレオチドをU6プロモーターベクターに挿入したコンストラクトを作製した.このプラスミドをC2C12細胞にトランスフェクトさせノックダウンを行い,機能解析を行ったところ,ALP活性,オステオカルシンmRNA発現の減少ならびにId1遺伝子のBMP2応答領域に対する反応性が低下し,骨芽細胞への分化が抑制された,これらの結果からインテグリンからのシグナルはβ-cateninを介して骨芽細胞分化を制御していることが明らかとなった.

研究成果

• [雑誌論文] Hepatocyte growth factor/scatter factor stimulates migration of muscle precursors in developing mouse tongue. (2004)
  • 著者名/発表者名: Bandow, K.
  • 雑誌名: J.Cell Physiol. 201 ページ: 236-243
• [雑誌論文] Regulation of mRNA expression of matrix extracellular phosphoglycoprotein (MEPE)/osteoblast/osteocyte factor 45 (OF45) by fibroblast growth factor 2 in cultures of rat bone marrow-derived osteoblastic cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Zhang, G.X.
  • 雑誌名: Endocrine. 24 ページ: 15-24
• [雑誌論文] Periodontal ligament cells under intermittent tensile stress regulate mRNA expression of osteoprotegerin and tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1 and -2. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tsuji, K.
  • 雑誌名: J.Bone Mineral Metab. 22 ページ: 94-103
• [雑誌論文] Extracellular Inorganic Phosphate Regulates Glvr-2 Phosphate Transporter/Retrovirus Receptor mRNA Expression In Rat Bone Marrow Stromal Cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Wada, K.
  • 雑誌名: J.Cell Physiol. 198 ページ: 40-47
• [雑誌論文] Enhanced cementum formation in experimentally-induced cementum defects of the root surface with the application of recombinant basic fibroblast growth factor in collagen gel in vivo. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sato, Y.
  • 雑誌名: J.Periodontol 75 ページ: 243-248
• [雑誌論文] Carrier dependent cell differentiation of bone morphogenetic protein-2 induced osteogenesis and chondrogenesis during the early implantation stage in rats. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takita, H.
  • 雑誌名: J Biomed.Mater.Res. 71A ページ: 181-189
• [文献書誌] Tamura, M.: "Intracellular mRNA cleavage by 3´ tRNase under the direction of 2´-O-methyl RNA heptamers"Nucleic Acid Res.. 31. 4354-4360 (2003)
• [文献書誌] Nakamura, T.: "Effects of growth/differentiation factor-5 on human periodontal ligament cells."J.Periodontal.Res.. 38. 597-605 (2003)
• [文献書誌] Wada, K.: "Extracellular inorganic phosphate regulates gibbon ape leukemia virus receptor 2/phosphate transporter mRNA expression in rat bone marrow stromal cells"J.Cell Physiol.. 198. 40-47 (2004)
• [文献書誌] Sato, Y.: "Enhanced cementum formation in experimentally-induced cementum defects of the root surface with the application of recombinant basic fibroblast growth factor in collagen gel in vivo."J.Periodontol.. 75. 243-248 (2004)
• [文献書誌] Tsuji, K.: "Periodontal ligament cells under intermittent tensile stress regulate mRNA expression of osteoprotegerin and tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1 and -2."J.Bone Mineral Metab.. 22. 94-103 (2004)
• [文献書誌] Bandow, K.: "Hepatocyte growth factor/scatter factor stimulates migration of muscle precursors in developing mouse tongue."J.Cell Physiol.. (印刷中). (2004)