ミトコンドリア発生スーパーオキサイドの半定量的検出法の開発

• 研究課題/領域番号: 15659451
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 病態科学系歯学・歯科放射線学
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 馬嶋 秀行 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60165701)
• 研究分担者: 犬童 寛子 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (00301391) ; 末永 重明 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (00136889)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円); 2004年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
• キーワード: ミトコンドリア / スーパーオキサイド / 検出法 / トラッピング剤 / 蛍光試薬

研究概要

本研究の目的は、細胞内ミトコンドリア発生スーパーオキサイドの検出法を世界に先駆けて開発することである。活性酸素の検出には電子スピン共鳴法(ESR)を用いる。今までのESR装置ではミトコンドリア内発生スーパーオキサイドの検出は検出限界以下であり、申請者も試みたが成功しなかった。最近このESR装置の感度をおよそ100倍以上高くする装置(RRX-1X)が開発され、当教室に世界2号機を購入した。本研究ではこの装置を用いた。
本年度は、平成15年度の結果を踏まえ、継続して当教室で保有のヒト培養細胞(ヒト骨芽細胞腫細胞;143B)に照射(0〜15Gy)後のミトコンドリア発生スーパーオキサイドのESR装置(RRX-1X)を用い半定量的検出を試みた。
スピントラップ剤には、5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)が最も一般に使用されているヒドロキシラジカルを捕獲するスピントラッピング剤である。最終0.69mM濃度でDMPOを使用し、照射2時間後の細胞内活性酸素発生検出を試みたが、検出されなかった。一方、スーパーオキサイドに対し感受性の優れる5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline-N-Oxide(DEPMPO)を使用(最終濃度10mM)し、同様に照射2時間後の活性酸素検出を試みたが、やはり検出されなかった。しかし、細胞内、スーパーオキサイドを除去する酵素である、スーパーオキサイドディスムターゼ(MnSOD)に対するRNAiを作成し、トランスフェクトさせた場合のみ、スーパーオキサイドのシグナルが観察された。これにより、ミトコンドリア由来のスーパーオキサイド検出が見られた。しかし、感度の面で、スーパーオキサイド発生を増大させないと見られないことも分かった。

研究成果

• [雑誌論文] Levels of reactive oxygen species and primary antioxidant enzymes in WI38 versus transformed WI38 cells following bleomcyin treatment. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yen HC, Chang HM, Majima HJ
  • 雑誌名: Free Radic Biol Med 38(7) ページ: 950-959
• [雑誌論文] Frequent retention of heterozygosity for point mutations in p53 and Ikaros in N-ethyl-N- nitrosourea-induced mouse thymic lymphomas (2005)
  • 著者名/発表者名: Kakinuma S, Nishimura M, Kubo A, Nagai J, Amasaki Y, Majima HJ
  • 雑誌名: Mutation Research (In press)
• [雑誌論文] Increased expression of humanin peptide in diffuse type pigmented villonodular synovitis : implication of its mitochondrial abnormality (2004)
  • 著者名/発表者名: Ijiri K, Tsuruga H, Sakakima H, Tomita K, Taniguchi N, Shimo-Onoda K, Komiya S, Goldring MB, Majima HJ, Matsuyama T
  • 雑誌名: Ann Rheum Dis
• [雑誌論文] Evaluation of anti-plateled aggregatory effects of aspirin, cilostazol and ramatroban on platelet-rich plasma and whole blood (2004)
  • 著者名/発表者名: Kariyazono H, Nakamura K, Arima J, Ayukawa O, Onimaru S, Masuda H, Iguro Y, Majima HJ, Ryuzo Sakata R, Yamada K
  • 雑誌名: Blood Coagulation & Fibrinolysis 15(2) ページ: 157-167
• [雑誌論文] Mitochondrial Signal Lacking Manganese Superoxide Dismutase Failed to Prevent Cell Death by Reoxygenation following Hypoxia in a Human Pancreatic Cancer Cell Line, KP4 (2004)
  • 著者名/発表者名: Hirai F, Motoori S, Kakinuma S, Tomita K, Indo HP, Kato H, Yamaguchi T, Yen H-C, St.Clair DK, Nagano T, Ozawa T, Saisho H, Majima HJ
  • 雑誌名: Antioxidant & Redox Signaling 6(3) ページ: 523-535
• [文献書誌] F.Hirai, K.Tomita, H.P.Indo, D.K.St.Clair T.Ozawa, H.J.Majima et al.: "Mitochondrial Signal Lacking Manganese Superoxide Disniutase Failed to Prevent Cell Death by Reoxygenation following Hypoxia in a Human Pancreatic Cancer Cell Line, KP4."Antioxidant & Redox Signaling. (in press). (2004)
• [文献書誌] H.Kariyazono, K.Nakamura, H.J.Majima, R.Sakata, K.Yamada et al.: "Evaluation of anti-platelet aggregatory, effects of aspirin, cilostazol and ramatroban on platelet-rich nlasma and whole blood."Blood Coagulation & Fibrinolysis. (in press). (2004)
• [文献書誌] S.Kakinuma, A.Kubo, Y.Amasaki, K.Nojima, H.Maiima et al.: "Loss of heterozygosity in heavy-ion-induced marine T-cell lymphomas."Biological Sciences in Space. 17・3. 187 (2003)