窒素に応答したダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子転写調節因子の同定

研究課題

研究課題/領域番号	15688003
研究種目	若手研究(A)
配分区分	補助金
研究分野	植物栄養学・土壌学
研究機関	新潟大学
研究代表者	大竹憲邦新潟大学, 自然科学系, 助手 (50313507)
研究期間 (年度)	2003 – 2005
研究課題ステータス	完了 (2005年度)
配分額 *注記	30,160千円 (直接経費: 23,200千円、間接経費: 6,960千円) 2005年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円) 2004年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円) 2003年度: 26,390千円 (直接経費: 20,300千円、間接経費: 6,090千円)
キーワード	ダイズ / 種子貯蔵タンパク質 / 転写調節タンパク質 / 無機ピロリン酸フォスファターゼ / SEF1 / βサブユニット / クロマチンモデリングファクター / SWI / SNF複合体 / ダイズ種子 / 貯蔵タンパク質 / 窒素応答 / 上流転写調節領域 / フォスファターゼ / ミヤコグサ / 上流転写領域 / マクロアレイ
研究概要	これまでダイズ種子貯蔵タンパク質の一つであるβサブユニットは利用可能なグルタミン濃度により集積量が調節されることを明らかにしてきた。窒素欠乏ダイズに対する高濃度窒素供給が登熟種子の遺伝子発現に与える影響についてミヤコグサマクロアレイを用い網羅的に解析したところ、無機ピロリン酸フォスファターゼが関与している可能性が示唆された。未熟子葉のin vitro培養系において、オルトバナジン酸によりフォスファターゼ活性を阻害し、更に無機リン酸を10mM添加する実験を行ったところβサブユニットmRNA集積はフォスファターゼの活性を阻害していない時と同程度に回復した。従ってダイズ登熟種子では窒素供給量の増加を無機リン酸の生成量で検知しシグナル伝達している可能性が強く示唆された。 βサブユニット遺伝子上流プロモータ領域のデリーションラインを用いて転写調節領域における窒素応答領域について解析し、調節領域に結合するタンパク質の同定を行った。前年度までに窒素応答配列は転写開始点-732bpから-631bpまでの101bpの間であることを明らかにしてきた。この領域にはすでにDNA結合タンパク質であるSEF1が認識する配列が報告されているため、SEF1認識配列を含む25bpをタンデムに並べたプライマーを作成し、酵母ワンハイブリッドシステムによりDNA結合タンパク質を検索した。in vitroにおいて明確なタンパク質の発現が認められた一つについてin vitro翻訳産物と合成オリゴペプチドと混合し、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、ダイズ未熟子葉の核タンパクを混合した時とほぼ同じ位置にシフトしたバンドが認められ、これがダイズ種子において窒素応答により転写を調節するタンパク質である可能性が示された。この遺伝子は日本DNAデータバンクに登録し、アクセッションナンバーAB250760を得た。このタンパク質は酵母で知られているクロマチンモデリングファクターの活性ドメインを持つことがタンパク質の配列から予測された。