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生きた細胞内における遺伝子診断を可能にする機能性核酸プローブの設計

研究課題

研究課題/領域番号 15750141
研究種目

若手研究(B)

配分区分補助金
研究分野 生体関連化学
研究機関京都大学

研究代表者

山東 信介  京都大学, 工学研究科, 助手 (20346084)

研究期間 (年度) 2003 – 2004
研究課題ステータス 完了 (2004年度)
配分額 *注記
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2004年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2003年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
キーワードゲノム / DNAzyme / 遺伝子 / アロステリック / 診断 / FRET / 蛍光 / 消光 / 遺伝子診断 / 細胞 / DNA酵素 / 細胞内遺伝子診断 / 大腸菌 / 薬剤 / スクリーニング
研究概要

"細胞膜内における遺伝子検出・診断"を可能にするプローブとして、申請者は標的核酸をアロステリックエフェクターとする自己切断核酸配列(TASC)を提案してきた。まず、コンセプトとの実証に向けて、大腸菌rRNA-12MG1655 strainの16srRNAを標的としたTASCシステムをデザインし、in vitro系における遺伝子検出実験を行った。具体的には、5末端をフルオレセインでラベル化したTASCプローブを設計、合成し、16srRNA存在下における自己切断速度を求めた。その結果、従来のプローブデザインでは、標的非存在下においても、ある程度の自己切断が起こっており、細胞膜内における増幅型遺伝子検出に大きく影響を及ぼすことが予想された。そこで、標的核酸存在下における自己切断速度を軽減するため、TASCシステム中にヘアピンロック構造を形成する核酸配列を導入したLocked TASCプローブを新たにデザインし、この問題を克服した。実際にLocked-TASCシステムを合成し、その活性を測定したところ、およそ、20倍程度のON/OFF効率の上昇が見受けられた。
そこで、この改良型TASCプローブに5末端蛍光分子、鎖内消光分子(ダブシル)を導入したFRET型のLocked TASCプローブを設計・合成した。本プローブを用いた細胞外での確認実験のあと、パラホルムアルデヒドで固定化した大腸菌を用いた細胞膜内遺伝子検出実験を行った。その結果、細胞膜内における遺伝子検出、ならびに、細胞膜内におけるシグナルの等温増幅が確認された。

報告書

(2件)
  • 2004 実績報告書
  • 2003 実績報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて 2004 その他

すべて 雑誌論文 (1件) 産業財産権 (1件) 文献書誌 (1件)

  • [雑誌論文] Locked TASC Probe for Homogeneous Sensing of Nucleic Acids and Imaging of Fixed E.coli Cells

    • 著者名/発表者名
      Shinsuke Sando, Atsushi Narita, Toshinori Sasaki, Yasuhiro Aoyama
    • 雑誌名

      Organic & Biomolecular Chemistry (in press)

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [産業財産権] 核酸プローブ検出方法・デバイス及び反応速度を制御する方法2004

    • 発明者名
      青山 安宏, 山東 信介, 佐々木 要徳
    • 産業財産権番号
      2004-165084
    • 出願年月日
      2004-06-02
    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [文献書誌] Shinsuke Sando, Toshinori Sasaki, Keiichiro Kanatani, Yasuhiro Aoyama: "Amplified Nucleic Acid Sensing Using-Programmed Self-Cleaving DNAzyme"Journal of the American Chemical Society. 125. 15720-15721 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書

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公開日: 2003-04-01   更新日: 2016-04-21  

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