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ニワトリB細胞株を利用する抗体の分子進化システムの構築と応用

研究課題

研究課題/領域番号 15760589
研究種目

若手研究(B)

配分区分補助金
研究分野 生物機能・バイオプロセス
研究機関岡山大学

研究代表者

金山 直樹  岡山大学, 工学部, 講師 (70304334)

研究期間 (年度) 2003 – 2004
研究課題ステータス 完了 (2004年度)
配分額 *注記
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2004年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2003年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
キーワード分子進化工学 / タンパク質工学 / 抗体 / DT40 / 遺伝子変換
研究概要

本研究は、DT40細胞の抗体遺伝子改変能力を利用して、抗体の分子進化システムを構築することを目的としている。昨年度、DT40細胞株において抗体遺伝子への突然変異と遺伝子変換の導入を厳密かつ任意に制御するために、突然変異と遺伝子変換に必須の因子であるAID遺伝子の発現をCre/loxPシステムを用いた遺伝子組み換えによって制御できる細胞株の育種を達成した。この細胞は、導入したCre-ERにより、4-hydroxytamoxyfen(4-OHT)添加時にloxPで挟まれたAIDの発現をON/OFFする。AIDの発現はGFPの発現でモニターし、AID OFFの時はピューロマイシン耐性として選択できる。
本年度、この細胞の変異能力とスイッチ能力について評価した。4-OHTで48時間処理後、48時間追加培養したところ、OFF細胞から平均20%のGFP陽性細胞が出現した。このGFP陽性をセルソーターによって一細胞ずつ分離してAID ON細胞として培養した。2ヶ月間の継続培養後、ほぼすべてがGFP陽性であり、AIDの発現が安定して維持されていることが明らかになった。また、抗体軽鎖遺伝子上に蓄積された変異を解析したところ、解析した24クローン中13クローンで変異が認められ、DT40が本来有している能力に相当するあるいはそれ以上の変異能力を有していた。さらに、ON細胞を4-OHT処理したところ、平均50%のGFP陰性細胞が出現し、ピューロマイシン添加によりOFF細胞のみに純化できた。このOFF細胞から、再度の4-OHT処理でON細胞が出現し、ON細胞の単離、培養、OFF細胞へのスイッチが繰り返し可能であった。すなわち、この細胞を用いて、有用な変異体を取得後、AID OFFにより変異を固定し、再度ONにして抗体遺伝子に二次的変異を導入して改良することが可能になった。

報告書

(2件)
  • 2004 実績報告書
  • 2003 実績報告書
  • 研究成果

    (2件)

すべて 2005 2004

すべて 雑誌論文 (1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Reversible switching of immunoglobulin hypermutation machinery in a chicken B cell line2005

    • 著者名/発表者名
      金山直樹
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications 327

      ページ: 70-75

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [産業財産権] 細胞の遺伝子変異機能の制御による変異蛋白質の作成方法2004

    • 発明者名
      大森 斉, 金山 直樹
    • 権利者名
      岡山大学
    • 産業財産権番号
      2004-298072
    • 出願年月日
      2004-10-12
    • 関連する報告書
      2004 実績報告書

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公開日: 2003-04-01   更新日: 2016-04-21  

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