| 研究課題/領域番号 |
15770066
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
吉村 成弘 京大, 生命科学研究科, 助手 (90346106)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2004年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2003年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | 染色体 / クロマチン / 核内マトリクス / 原子間力顕微鏡 |
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| 研究概要 |
発現ライブラリのスクリーニングによるモノクローナル抗体の抗原決定
・染色体より抽出したタンパク質を抗原としてハイブリドーマを作成し、54種190個のクローンを得た。
・54種のうち、22個は核内の構造物を、11個は細胞骨格、7個は紡錘体、14個はその他の細胞内器官を認識した。
・発現ライブラリのスクリーニングにより、10種類のハイブリドーマに関して抗原を決定した。
・モノクローナル抗体(#04A)の抗原として同定された新規タンパク質は、641アミノ酸から構成され、中央部にJmjCドメイン、N末端近傍に核局在シグナル(NLS)を持つものであった。
・このタンパク質にタグを付加してHeLa細胞で発現させると、核小体への局在が確認された。
試験管内での高次クロマチンファイバーの再構成
3kbから100kbまで長さの異なるプラスミドDNA(環状スーパーコイル状態)を調整し、これらを用いて塩透析法でクロマチンファイバーを再構成した。これを原子間力顕微鏡を用いて観察・解析し、次のような成果を得た
・用いたDNAが長いほど、高い密度でヌクレオソームが形成される。
・この相関関係は、負にスーパーコイルした環状プラスミドにのみみられ、直鎖状DNAや、弛緩型環状プラスミドではみられなかった。
・リンカーヒストンH1を加えると、クロマチンがさらに折りたたまれて、より太いファイバー状の構造を形成される。
ハイブリッドイメージング技法の確立
AFM像中に、特定のタンパク質の所在をプロットするために、AFMと蛍光顕微鏡とを組み合わせたシステムを構築した。GFPを融合させたPMLタンパク質(核内マトリクスに局在)をガラス基板上で培養したHeLa細胞内に発現させ、その基板上で核マトリクスを精製したのちこれを蛍光顕微鏡とAFMとで観察した結果、PMLタンパク質が局在する部位(PMLボディー)の微細構造をAFMで観察することに成功した。
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