担子菌類由来のセルロース分解酵素に対する部位特異的変異の導入と触媒機構の解析

• 研究課題/領域番号: 15780206
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 環境農学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 五十嵐 圭日子 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (80345181)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円); 2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2003年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
• キーワード: セルロース分解 / 木材腐朽菌 / セロビオース脱水素酵素 / β-グルコシダーゼ

研究概要

昨年度メタノール資化性酵母による大量発現の構築に成功した白色木材腐朽担子菌Phanerochaete chrysosporium由来のβ-グルコシダーゼに関して反応速度論的解析を行い、加水分解と同時に糖転移反応が起こっていることを明らかにし、これまで基質阻害と考えられてきた現象が糖転移反応によるものであることを定量的に証明した。この結果はCarbohydrate Research 339号2851-2857頁に掲載された。
さらに昨年度部位特異的変異の導入に成功したP.chrysosporium由来のセロビオース脱水素酵素は、昨年度作成した166番のフェニルアラニンをチロシンに置換した酵素(F166Y)に関して、定常状態における反応を調べるとともに、ストップトフロー分光光度計を用いて前定常状態における酸化還元反応を詳細に調べ、本酵素が電子伝達鎖反応によって酸化還元反応を行っていることを明らかにした。この結果は現在FEBS Journalに投稿中である。
また、上述の部位特異的変異を導入した酵素に加えて、90番のチロシンをフェニルアラニンに置換した酵素(Y90F)、および90番のチロシンと166番のフェニルアラニン双方に変異を導入した酵素(Y90F/F166Y)を作成し、それらにおける電子伝達速度を詳細に調べた。その結果90番のチロシンが電子伝達に重要な役割を担っていることを明らかにし、その結果を第55回日本木材学会大会において発表した。

研究成果

• [雑誌論文] Kinetics of substrate transglycosylation by glycoside hydrolase family 3 glucan 1,3-β-glucosidase from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium (2004)
  • 著者名/発表者名: Kawai, R., Igarashi, K., Ishii, T., Kitaoka, M., Samejima, M.
  • 雑誌名: Carbohydrate Research 339 ページ: 2851-2857
• [雑誌論文] Characterization and molecular cloning of cellobiose dehydrogenase from the brown-rot fungus Coniophora puteana. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kajisa, T., Yoshida, M., Igarashi, _K., Katayama, A., Nishino, T., Samejima, M.
  • 雑誌名: Journal of Bioscience Bioengineering 98 ページ: 57-63
  • NAID: 110002665335
• [雑誌論文] 糸状菌によるセルロース生分解機構とその関連酵素をとりまく最近の研究動向 (2004)
  • 著者名/発表者名: 鮫島正浩, 五十嵐圭日子
  • 雑誌名: 木材学会誌 50 ページ: 1-9
• [雑誌論文] 三重バイオフォーラム2003に参加して「セルラーゼ研究とバイオマス利用における構造生物学とゲノム生物学の新しい潮流」 (2004)
  • 著者名/発表者名: 五十嵐圭日子
  • 雑誌名: Cellulose Communication 11 ページ: 35-38
• [文献書誌] Igarashi.K., Tani, T., Kawai, R., Samejima, M.: "Family 3 β-glucosidase from cellulose-degrading culture of the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium is a glucan 1,3-β-glucosidase"Journal of Bioscience and Bioengineering. 95. 572-576 (2003)
• [文献書誌] Kawai, R., Yoshida, M., Tani, T., Igarashi, K., Ohira, T., Nagasawa, N., Samejima, M.: "Production and characterization of recombinant Phanerochaete chrysosporium β-glucosidase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris,"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67. 1-7 (2003)
• [文献書誌] 鮫島正浩, 五十嵐圭日子: "酸化還元反応が関与する白色木材腐朽菌のセルロース分解機構"化学と生物. 41. 22-26 (2003)
• [文献書誌] 五十嵐圭日子, 鮫島正浩: "生分解性プラスチックの改質技術と成形加工における課題と対策"技術情報協会. 5 (2003)