架橋試薬を用いたレクチン-糖タンパク質間相互作用の解析

研究課題

研究課題/領域番号	15790048
研究種目	若手研究(B)
配分区分	補助金
研究分野	生物系薬学
研究機関	帝京大学
研究代表者	荒田洋一郎帝京大学, 薬学部, 講師 (90246017)
研究期間 (年度)	2003 – 2004
研究課題ステータス	完了 (2004年度)
配分額 *注記	3,500千円 (直接経費: 3,500千円) 2004年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円) 2003年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
キーワード	レクチン / ガレクチン / 糖タンパク質 / 架橋 / 相互作用 / 糖鎖 / β-ガラクトシド
研究概要	レクチンと糖タンパク質の相互作用は生体内で非常に重要な役割を担っているが、ガレクチンのように弱い相互作用をするものもある。このため重要な生理機能をもつ生体内リガンドが従来のアフィニティカラムなどによる単離法では同定されていない可能性がある。本研究ではレクチンとリガンド糖タンパク質の架橋試薬による架橋法を確立し、新たな生体内リガンドの単離をめざした。ヘテロな認識タンパク質としての機能が予想されているガレクチンLEC-1は同一ポリペプチド内に2箇所の糖結合ドメインを繰り返しもっている。X線結晶解析のデータから、タンパク質の外側表面を向いていてかつ親水性であり、糖結合部位に比較的近い(認識されている糖タンパク質との結合は妨げず、かつ2価性架橋試薬により架橋が可能になりそうな位置を予測する)アミノ酸をN末端側レクチンドメイン、C末端側レクチンドメインより8個ずつ選んだ。まず初めに、変異導入後の塩基配列再確認が容易に行えるよう、LEC-1のcDNAに2箇所塩基配列置換を導入し(アミノ酸配列は変化させない)、各レクチンドメインそれぞれについて別々の鋳型を用いてCys残基導入の変異が行えるようにした。これを新たな鋳型として、選んだアミノ酸1箇所ずつをCysに置換したCys残基導入LEC-1のcDNAを16種類(各ドメインごとに8種類ずつ)の構築を行った。さらにこれらのCys残基導入LEC-1のcDNAを蛋白質発現用プラスミドpET21aに導入し、発現用プラスミド16種類を構築した。現在は変異導入LEC-1の大量発現、精製、及び架橋試薬による反応条件を検討中である。