二本鎖RNAを用いたSmad結合タンパク1(Sip1)の核内シグナル伝達の解明

• 研究課題/領域番号: 15790067
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所
• 研究代表者: 山田 憲一郎 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 遺伝学部, 研究員 (30291173)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2004年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2003年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: ZFHX1B / Sip1 / siRNA / ヒルシュスプルング病症候群 / 知的障害

研究概要

我々は、ヒルシュスプルング病症候群がZFHX1B(Smad interacting protein-1 (Sip1)をコードする)の異常で発症することを初めて明らかにした。本研究は、本症の病態を分子レベルで明らかにするために、siRNAを用いて培養細胞及びマウスの初代脳培養細胞内のSip1の機能を阻害し、その結果生じる様々な遺伝子の発現異常や、神経細胞の形態変化等を明らかにすることを目的としている。
ZFHX1BをノックダウンするsiRNAの作製を行った。(1)4種類のSip1に特異的な配列のsiRNAをin vitroで合成した。これらのsiRNAを293細胞に導入し、Sip1の発現量をRT-PCR法により定量した。1種類のsiRNAが、Sip1の発現量を何も加えないコントロールに比べ約30%抑制していた。(2)ヒトSip1の開始コドンから約600bp領域の2本鎖RNAを作製し、Dicer酵素により約25merの断片にしたsiRNAを293細胞に導入した。Sip1発現量はコントロールに比べ、約60%抑制された。(3)9種類のsiRNA配列をpSUPERに挿入し、siRNAを細胞内で発現するベクターを作製した。また、Luciferaseの3'-非翻訳領域に、上記のsiRNAの標的となるSip1の配列を挿入したsiCHECKベクターも作製した。293細胞に上記のsiRNA発現ベクターとsiCHECKベクターを同時に導入後、Luciferase活性を測定し、siRNAの発現抑制効果を評価した。1種類のベクターが、コントロールに比べ約80%抑制していた。(3)で作製したsiRNAベクターは、sip1の機能を十分に阻害できることが明らかとなった。現在、マウスのP19細胞にsiRNA発現ベクターを導入し、神経細胞の形態変化の異常等を解析している。

研究成果

• [雑誌論文] Mutations in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase gene (HPRT1) inAsian HPRT deficient families. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamada Y, Yamada K, Sonta S, Wakamatsu N, Ogasawara N.
  • 雑誌名: Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid 8&9 ページ: 1173-1176
• [雑誌論文] Disruption in the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene caused by translocation in a patient with Lesch-Nyhan syndrome. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mizunuma M, Yamada Y, Yamada K. Wakamatsu N, et al.
  • 雑誌名: Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid 8&9 ページ: 1169-1172
• [雑誌論文] Clinical and molecular analysis of Mowat-Wilson syndrome associated with ZFHX1B mutations and deletions at 2q22-q24.1. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ishihara N, Yamada K.Yamada Y, Wakamatsu N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Medical Genetics 41 ページ: 387-393
• [文献書誌] Yamada Y, Yamada K, Sonta S, Wakamatsu N, Ogasawara N.: "Mutations in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase gene (HPRT1) in Asian HPRT deficient families."Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid. (in press). (2004)
• [文献書誌] Mizunuma M, Yamada Y, Yamada K, Wakamatsu N, et al.: "Disruption in the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene caused by translocation in a patient with Lesch-Nyhan syndrome."Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid. (in press). (2004)
• [文献書誌] Ishihara N, Yamada K, Yamada Y, Wakamatsu N, et al.: "Clinical and molecular analysis of Mowat-Wilson syndrome associated with ZFHX1B mutations and deletions at 2q22-q24.1."Journal of Medical Genetics. (in press). (2004)