発生早期の鳥類頚髄における運動神経細胞死の過程で働く因子の検討

• 研究課題/領域番号: 15790108
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 解剖学一般(含組織学・発生学)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小池 正人 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (80347210)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円); 2004年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2003年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
• キーワード: プログラム細胞死 / 鶏胚 / 頸髄 / 運動神経細胞 / オートファジー / LC-3 / 電気穿孔法 / SDS-FRL / MAP-LC3 / GFP / 鳥胚 / 頚髄 / カスパーゼ / 阻害剤

研究概要

鶏胚脊髄運動神経細胞へ効率よくGFP-LC3遺伝子を発現させる目的で、運動神経における転写因子であるIslet1のエンハンサーのもとで同遺伝子が発現するコンストラクトを福島県立医科大学の佐藤昇博士と共同で作製し、孵卵2日目(Hamburger-Hamiltonのステージ13〜14)の胚に遺伝子導入を行ない、蛍光顕微鏡でGFP融合蛋白の発現の有無を観察した。その結果脊髄前角細胞に同遺伝子を効率よく発現していることを見出し、本コンストラクトが運動神経特異的に効率よく遺伝子導入する上で有用であることが分った。そこで、GFP-LC3遺伝子を導入した胚に、Yaginuma(2001)らと同じ条件で、カスパーゼの阻害剤を投与して頚髄の細胞死が運命付けられた運動神経細胞(Apoptosis-specific protein(ASP)陽性細胞)と、そうでない細胞の間での、GFPの細胞内局在パターンの相違の有無を検討した。ASP陽性細胞にても、GFP-LC3蛋白が発現していることが共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析から明らかとなったが、GFPの輝度が高く光学顕微鏡における細胞内局在の詳細な評価は困難であった。そこで免疫電子顕微鏡法で局在を検討することを試みた。ただし通常の免疫電子顕微鏡法(樹脂包埋、凍結超薄切片法)ではLC3蛋白の局在を検討することは非常に困難であることが分っているので、固定条件が弱くても行うことの出来る、フリーズレプリカ免疫電顕法(SDS-FRL)により同蛋白を同定する系をオートファジーが非常に亢進し膜結合型のLC3蛋白が豊富に存在することが分っているカテプシンD欠損マウス脳を用いて確立することを目指した。その結果2%パラホルムアルデヒド固定という非常に弱い固定条件で、LC3蛋白が膜内粒子にとぼしい初期のオートファゴソームと思われる膜に局在することを示すことに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Survival of developing motor neurons mediated by Rho GTPase signaling pathway through Rho-kinase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, K., Takahashi, M., Matsushita, N., Miyazaki, J., Koike, M., Yaginuma, H., Ohsumi, N., Kaibuchi, K., Kobayashi, K.
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience 24巻14号 ページ: 3480-3488
• [雑誌論文] Discovery of a Second Form of Tripartite Complex Containing gH-gL of Human Herpesvirus 6 and Observations on CD46. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mori, Y., Akkapaiboon, P., Yonemoto, S., Koike, M., Takemoto, M., Sadaoka, T., Sasamoto, Y., Konishi, S., Uchiyama, Y., Yamanishi, K.
  • 雑誌名: Journal of Virology 78巻9号 ページ: 4609-4616
• [雑誌論文] Autoimmune Disease and Impaired Uptake of Apoptotic Cells in Germinal Centers MFG-E8-deficient mice. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hanayama, R., Tanaka, M., Miyasaka, K., Aozasa, K., Koike, M., Uchiyama, Y., Nagata, S.
  • 雑誌名: Science 304巻5674号 ページ: 1147-1150
• [雑誌論文] Participation of Autophagy in the Degeneration Process of Rat Hepatocytes after Transplantation following Prolonged Cold Preservation.
  • 著者名/発表者名: Lu, Z., Dono, K., Gotoh, K., Shibata, M., Koike, M., Marubashi, S., Miyamoto, A., Takeda, Y., Nagano, H., Umeshita, K., Uchiyama, Y., Monden, M.
  • 雑誌名: Arch.Histol.Cytol (印刷中)
  • NAID: 10015565050
• [文献書誌] Ishii, T ら: "A case of multicentric Castleman's disease demonstrating severe eosinophilia and enhanced production of interleukin-5."Eur.J.Haematol. 70巻・2号. 115-118 (2003)
• [文献書誌] Ohsawa, Y ら: "Purification, cDNA cloning, and secretory properties of FLRG protein from PC12 cells and the distribution of FLRG mRNA and protein in rat tissues."Arch.Histol.Cytol.. 66巻・4号. 367-381 (2003)
• [文献書誌] Ezaki, J ら: "Characterization of Cln3p, the gene product responsible for juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis, as a lysosomal integral membrane glycoprotein."J.Neurochem.. 87巻・5号. 1296-1308 (2003)
• [文献書誌] Kobayashi, K ら: "Survival of developing motor neurons mediated by Rho GTPase signalina pathway through Rho-kinase."J.Neurosci.. (印刷中).
• [文献書誌] Mori, Y ら: "The discovery of a second form of tripartite complex containing gH-gLof human herpesvirus-6, and the CD46 observations."J.Virol.. (印刷中).