| 研究課題/領域番号 |
15790221
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡 清正 阪大, 微生物病研究所, 助手 (70314474)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2004年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | Pasteurella multocida毒素 / 細胞内標的分子 / 細胞増殖 / 発現クローニング / DNA合成 / サイクリンA |
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| 研究概要 |
Pasteurella multocida毒素(PMT)は培養細胞に対して強い増殖促進因子として働き、細胞周期が静止期にある細胞のDNA合成を誘導する。現在まで、PMTの作用機構に関してはほとんど分かっでいない。本研究ではPMTの細胞内標的分子を明らかにするため、PMTによる細胞DNAの合成誘導を指標にした発現クローニングを試みた。
細胞周期がDNA合成期(S期)に移行するためにはサイクリンAの発現が必須である。そこで、サイクリンAプロモーターの下流にEGFPを結合させたプラスミド(pCyc.A-d2EGFP)をレポーター遺伝子として用いた。またEGFPの半減期は24時間以上で、このままではEGFP陽性細胞を分別する事が出来ないため、半減期が2時間となるように分解シグナルを付加したd2EGFPを用いている。レポーター遺伝子を導入するPMT非感受性細胞として、ヒト初代培養細胞をSV40で不死化させたHFI細胞を用いた。この細胞にpCyc.A-d2EGFPからSVoriを除いたものを導入し、安定発現株をFACSにより回収した。スクリーニングのためのcDNAライブラリーは、PMT高感受性細胞であるSwiss3T3細胞からmRNAを調製し、リンカープライマー法により作製した。このSwiss3T3cDNAライブラリーを先程のHFI細胞に導入後PMTを作用させ、EGFP陽性となった細胞をFACSで回収した。得られた細胞群からハート法によりプラスミドを回収した。このスクリーニングを合計3回行い、最終的に得られたクローンについて解析中である.
また、PMTは三量体GTP結合タンパク質Gqを介してホスフォリパーゼCを活性化すると考えられている。このシグナル伝達経路はGqと共役する膜受容体(GPCR)の活性化から始まるので、PMTの作用点も細胞膜にあると推測される。そこで、培養細胞、GPCRが多く存在する脳、PMTの作用が観察されたとの報告がある肝臓から膜画分を回収し、PMTを作用させてから2次元電気泳動を行った。様々な条件下で2次元電気泳動を行ったが、コントロールと差異のあるスポットは検出されていない
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