| 研究概要 |
1.マウス造血幹細胞の分離および培養、移植
C57BL/6-Ly5.1マウス由来の骨髄単核細胞から直接CD34陽性細胞を、あるいは分化抗原陰性細胞(Lin-)を得た後にCD34,Sca-1,c-kitの各蛍光抗体で染色し、セルソーターでCD34陰性(正常骨髄)あるいはCD34陽性(5-FU処理後骨髄)c-kit陽性Sca-1陽性分化抗原陰性(KSL)細胞を分離した。SCF/IL-11±IL-3の存在下で3-7日間培養し、致死量放射線照射C57BL/6-Ly5.2マウスに上記培養細胞を移植した。
2.移植マウスの末梢血を用いた生着率の解析結果
移植後2、4,6ヶ月のマウス末梢血でドナー由来細胞の比率を解析した。正常マウス由来定常期CD34陰性KSL細胞の短期間(3日間)培養では、IL-3添加群と非添加群では生着率に差違を認めなかったが、7日間培養ではIL-3添加群は非添加群に比べて有意に生着率が低かった。また5-FU投与後に得たCD34陽性KSL細胞では、3日間培養でもIL-3添加群は有意に低い生着率を示した。さらにマウス骨髄単核球から直接得たCD34陽性細胞による実験でも、5-FU同様に3日間培養でIL-3添加群は有意に低い生着率を示した。いずれも血清添加・無血清の培養条件で同様の結果を示し、IL-3Rは静止期よりもcyclingしている骨髄幹細胞でより機能すると推測された。
4.IL-3Rの発現解析
SCF/IL-11を加えた培養後の細胞表面IL-3Rの発現比較を行なった。フローサイトメトリーでは7日間培養後には3日後に比べて発現は高い傾向を示したが、有意な差は得られなかった。mRNA発現解析では、分離直後、3日間後、7日後とIL-3Rの発現は高くなる傾向を予想したが、安定した結果は示せなかった。PCR条件のさらなる改善が今後の課題である。
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