| 研究課題/領域番号 |
15791032
|
|---|
| 研究種目 |
若手研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
救急医学
|
|---|
| 研究機関 | 宮崎大学 (2004)
宮崎大学(医学部) (2003) |
|---|
研究代表者 |
松岡 博史 宮崎大学, 医学部, 助手 (30315379)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
|
| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
2003年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
|
|---|
| キーワード | Aeromonas属細菌 / 壊死性筋膜炎 / ヒアルロニダーゼ |
|---|
| 研究概要 |
平成15年度に引き続き、ヒアルロニダーゼ(HAase)の分離・精製を行った。
スクリーニング(Smith and Willettの方法)の結果、20株中3株がHAase陽性であった。陽性の3株はいずれも死亡例から分離されたものであった。この中の1株(KYO23株)の培養上清中に多量のHAaseが存在することが明らかになったため、本菌株からのHAase精製を試みた。
培養上清の60%硫安沈殿画分を出発材料とし、Phenyl Sepharose HPカラムを用いた疎水クロマトグラフィーおよびMonoQカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離精製を行った。MonoQ活性画分のSDS-PAGE解析では、60kDaのメジャーバンドと複数の微量タンパクが存在し、ザイモグラフィによる解析では、60kDaのメジャーバンドに一致してHAaseの活性が認められた。このメジャーバンドをPVDF膜にブロッティングし、N末端配列の解析を行った結果、LTTEYKILADの配列を得た。
このメジャーバンドの内部アミノ酸配列を得るためにprotenaseKを用いて限定分解したが、うまく分解できなかった。細菌より分泌される蛋白であり、ある種の蛋白分解酵素に抵抗性を有すると考えられた。そこで、臭化シアンを用いて分解を試みた。臭化シアンによりメジャーバンドはさらに4つのバンドに分かれることが確認された。これをPVDF膜にブロッティングし、内部配列のN末端解析を行ったが、充分な配列は得られなかった。その原因として不純物の混入が考えられたため、シアン分解した資料をさらに逆相クロマトグラフィーにより分離し、それぞれにN末端解析を行うこととし現在検索中である。
|
