| 研究概要 |
1.flk-1タンパク質の精製
COS-7細胞ヘプライマー3'-CCGGTACCATGGAGAGCAAGGCGCTG-5および'5'-CCTCTAGACAGCAGCACCTCTCTC-3'配列にて増幅したcDNAを制限酵素認識部位Kpn1およびXba1によって切断したpcDNA3.1ベクター(Invitrogen社)へエレクトロポレーション法を用いて挿入し,flk-1発現プラスミドベクターを用いてflk-1タンパクを作製している.COS-7細胞の超音波破砕後の溶出液より,Sephadex G-25カラムを使用したゲル濾過クロマトグラフィーにてflk-1タンパク質を精製している.溶出により得られたフラクションは,抗flk-1抗体(DC101)を用いてWestern blot法により確認している.また精製タンパクの活性は,ELISA法を用いたVEGFとの結合能により確認している.しかし,現在得られるflk-1タンパク質の収量が少なく,樹状細胞に抗原をパルスするほど得られていない.したがって,タンパク質の精製段階でアフィニティカラムを用いるためのより効率の良いTagを模索中である.
2.樹状細胞の誘導
C57BLマウス大腿骨より骨髄細胞を採取し,抗体処理によりT細胞/B細胞/マクロファージ/顆粒球などを除去,さらにサイトカイン(GM-CSF, IL-4)を添加し,インキュベーターにて7〜10日間培養しDCを誘導している.今後は,DCとflk-1ペプチドを特殊な培地(AIM Vなど)をもちいて共培養し,DCに抗原をパルスする予定である.
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