微生物のシステイングリコシダーゼの構造機能解析と反応機構解明

• 研究課題/領域番号: 15H02443
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
• 研究分担者: 藤田 清貴 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (20381189) ; 石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2019年度)
• 配分額: 42,120千円 (直接経費: 32,400千円、間接経費: 9,720千円); 2018年度: 9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円); 2017年度: 9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円); 2016年度: 9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円); 2015年度: 14,040千円 (直接経費: 10,800千円、間接経費: 3,240千円)
• キーワード: 酵素 / タンパク質 / 有機化学 / 応用微生物学 / 糖鎖 / 糖質関連酵素 / 植物病原菌 / 選択的化学合成 / 応用微生物 / 蛋白質

研究成果の概要

求核触媒が亜鉛に結合したCysという全く新しいタイプの活性中心を持つ糖質加水分解酵素（β-L-Araf-ase）であるHypBA1を見出し、反応機構の検証と関連酵素（タンパク質）の解析を行った。β-L-Araf-aseの活性中心と化学選択的に反応する阻害剤の立体選択的合成法を確立し、これを用いることによりHypBA1の全反応ステップの立体構造を解明した。さらに、新規β-L-Araf-aseを発見して、関連酵素ともに機能解析と構造解析を行った。β-アラビノオリゴ糖代謝経路に関わる酵素・タンパク質の特徴が明らかになった。

研究成果の学術的意義や社会的意義

活性中心がCysである糖質加水分解酵素としてはこれ以外に全く前例がなく新規な発見である。さらにHypBA1で反応前（酵素-基質ミカエリス型複合体）、反応中間体アナログ（ハロアセトアミド体阻害剤との複合体）、反応後（産物であるβ-L-Arafとの複合体）の全てで立体構造に成功し、反応機構を解明した。本酵素は善玉菌として有名な腸内細菌であるビフィズス菌が食品に含まれるβ-アラビノオリゴ糖分解に関わる経路で重要な役割を担っており、ヒトの健康に有効なプレバイオティクス開発に繋がると期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Structural analysis of β‐L‐arabinobiose‐binding protein in the metabolic pathway of hydroxyproline‐rich glycoproteins in Bifidobacterium longum (2020)
  • 著者名/発表者名: Miyake Masayuki、Terada Tohru、Shimokawa Michiko、Sugimoto Naohisa、Arakawa Takatoshi、Shimizu Kentaro、Igarashi Kiyohiko、Fujita Kiyotaka、Fushinobu Shinya
  • 雑誌名: The FEBS Journal 巻: in press 号: 23 ページ: 5114-5129
  • DOI: 10.1111/febs.15315
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of β-L-arabinobiosidase belonging to glycoside hydrolase family 121 (2020)
  • 著者名/発表者名: Keita Saito, Alexander Holm Viborg, Shiho Sakamoto, Takatoshi Arakawa, Chihaya Yamada, Kiyotaka Fujita, Shinya Fushinobu
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 号: 6 ページ: e0231513-e0231513
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0231513
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis for broad substrate specificity of UDP-glucose 4-epimerase in the human milk oligosaccharide catabolic pathway of Bifidobacterium longum (2019)
  • 著者名/発表者名: Nam Young-Woo、Nishimoto Mamoru、Arakawa Takatoshi、Kitaoka Motomitsu、Fushinobu Shinya
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 号: 1 ページ: 11081-11081
  • DOI: 10.1038/s41598-019-47591-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Understanding the Molecular Mechanism Underlying the High Catalytic Activity of p-Hydroxybenzoate Hydroxylase Mutants for Producing Gallic Acid (2019)
  • 著者名/発表者名: Moriwaki Yoshitaka、Yato Mirai、Terada Tohru、Saito Seiji、Nukui Noriyuki、Iwasaki Takumi、Nishi Tatsunari、Kawaguchi Yuko、Okamoto Ken、Arakawa Takatoshi、Yamada Chihaya、Fushinobu Shinya、Shimizu Kentaro
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 58 号: 45 ページ: 4543-4558
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00443
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two novel α-L-arabinofuranosidases from Bifidobacterium longum subsp. longum belonging to glycoside hydrolase family 43 cooperatively degrade arabinan (2019)
  • 著者名/発表者名: Komeno M, Hayamizu H, Fujita K, Ashida H
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 85 号: 6
  • DOI: 10.1128/aem.02582-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] Degradation of plant arabinogalactan proteins by intestinal bacteria: characteristics and functions of the enzymes involved. (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujita, K., Sasaki, Y. & Kitahara, K.
  • 雑誌名: Appl Microbiol Biotechnol 巻: 103 号: 18 ページ: 7451-7457
  • DOI: 10.1007/s00253-019-10049-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dissecting the Stereocontrolled Conversion of Short-Lived Sulfenic Acid by Lachrymatory Factor Synthase (2019)
  • 著者名/発表者名: Arakawa Takatoshi、Sato Yuta、Yamada Masayuki、Takabe Jumpei、Moriwaki Yoshitaka、Masamura Noriya、Kato Masahiro、Aoyagi Morihiro、Kamoi Takahiro、Terada Tohru、Shimizu Kentaro、Tsuge Nobuaki、Imai Shinsuke、Fushinobu Shinya
  • 雑誌名: ACS Catalysis 巻: 10 号: 1 ページ: 9-19
  • DOI: 10.1021/acscatal.9b03720
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of a GH36 β-L-Arabinopyranosidase in <i>Bifidobacterium adolescentis</i> (2018)
  • 著者名/発表者名: Sasaki Yuki、Togo Nami、Kitahara Kanefumi、Fujita Kiyotaka
  • 雑誌名: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ 巻: 65 号: 2 ページ: 23-30
  • DOI: 10.5458/jag.jag.JAG-2018_001
  • NAID: 130006742938
  • ISSN: 1344-7882, 1880-7291
  • 年月日: 2018-05-20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification, functional characterization, and crystal structure determination of bacterial levoglucosan dehydrogenase (2018)
  • 著者名/発表者名: Sugiura Masayuki、Nakahara Moe、Yamada Chihaya、Arakawa Takatoshi、Kitaoka Motomitsu、Fushinobu Shinya
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 293 号: 45 ページ: 17375-17386
  • DOI: 10.1074/jbc.ra118.004963
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bimodal Glycosyl Donors Protected by 2-O-(ortho-Tosylamido)benzyl Group (2018)
  • 著者名/発表者名: Ding Feiqing、Ishiwata Akihiro、Ito Yukishige
  • 雑誌名: Organic Letters 巻: 20 号: 14 ページ: 4384-4388
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.8b01922
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stereodivergent Mannosylation Using 2-O-(ortho-Tosylamido)benzyl Group (2018)
  • 著者名/発表者名: Ding Feiqing、Ishiwata Akihiro、Ito Yukishige
  • 雑誌名: Organic Letters 巻: 20 号: 16 ページ: 4833-4837
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.8b01979
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional characterization of unique enzymes in Xanthomonas euvesicatoria related to degradation of arabinofurano-oligosaccharides on hydroxyproline-rich glycoproteins (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Masayuki、Yasukawa Yuino、Furusawa Akira、Fuchiwaki Tamao、Honda Takashi、Okamura Yuta、Fujita Kiyotaka、Iwai Hisashi
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 13 号: 8 ページ: e0201982-e0201982
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0201982
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural and thermodynamic insights into β-1, 2-glucooligosaccharide capture by a solute-binding protein in Listeria innocua. (2018)
  • 著者名/発表者名: Abe, K., Sunagawa, N., Terada, T., Takahashi, Y., Arakawa, T., Igarashi, K., Samejima, M., Nakai, H., Taguchi, H., Nakajima, M., and Fushinobu, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 293 号: 23 ページ: 8812-8828
  • DOI: 10.1074/jbc.ra117.001536
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Degradative enzymes for type II arabinogalactan side chains in Bifidobacterium longum subsp. longum (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujita Kiyotaka、Sakamoto Ayami、Kaneko Satoshi、Kotake Toshihisa、Tsumuraya Yoichi、Kitahara Kanefumi
  • 雑誌名: Applied Microbiology and Biotechnology 巻: 103 号: 3 ページ: 1299-1310
  • DOI: 10.1007/s00253-018-9566-4
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular Insight into Evolution of Symbiosis between Breast-Fed Infants and a Member of the Human Gut Microbiome Bifidobacterium longum (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamada C, Gotoh A, Sakanaka M, Hattie M, Stubbs KA, Katayama-Ikegami A, Hirose J, Kurihara S, Arakawa T, Kitaoka M, Okuda S, Katayama T and Fushinobu S.
  • 雑誌名: Cell Chemical Biology 巻: 24 号: 4 ページ: 515-524
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2017.03.012
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The First Crystal Structure of a Family 129 Glycoside Hydrolase from a Probiotic Bacterium Reveals Critical Residues and Metal Co-factors (2017)
  • 著者名/発表者名: Mayo Sato, Dorothee Liebschner, Yusuke Yamada, Naohiro Matsugaki, Takatoshi Arakawa, Siobhan S. Wills, Mitchell Hattie, Keith A. Stubbs, Tasuku Ito, Toshiya Senda, Hisashi Ashida and Shinya Fushinobu
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 292 号: 29 ページ: 12126-12138
  • DOI: 10.1074/jbc.m117.777391
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Crystal Structure and Substrate Specificity Modification of Acetyl Xylan Esterase from Aspergillus luchuensis (2017)
  • 著者名/発表者名: Komiya Dai、Hori Akane、Ishida Takuya、Igarashi Kiyohiko、Samejima Masahiro、Koseki Takuya、Fushinobu Shinya
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 83 号: 20
  • DOI: 10.1128/aem.01251-17
  • 査読あり
• [雑誌論文] Discovery of α-l-arabinopyranosidases from human gut microbiome expands the diversity within glycoside hydrolase family 42 (2017)
  • 著者名/発表者名: Viborg Alexander Holm、Katayama Takane、Arakawa Takatoshi、Abou Hachem Maher、Lo Leggio Leila、Kitaoka Motomitsu、Svensson Birte、Fushinobu Shinya
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 292 号: 51 ページ: 21092-21101
  • DOI: 10.1074/jbc.m117.792598
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The crystal structure of an inverting glycoside hydrolase family 9 exo-β-D-glucosaminidase and the design of glycosynthase (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Honda, S. Arai, K. Suzuki, M. Kitaoka, and S. Fushinobu
  • 雑誌名: Biochem. J. 巻: 473 号: 4 ページ: 463-472
  • DOI: 10.1042/bj20150966
  • 査読あり
• [雑誌論文] Archaeal Mo-containing glyceraldehyde oxidoreductase isozymes exhibit diverse substrate specificities through unique subunit assemblies (2016)
  • 著者名/発表者名: T. Wakagi, H. Nishimasu, M. Miyake, and S. Fushinobu
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 11 号: 1 ページ: e0147333-e0147333
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0147333
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Crystal structure and identification of a key amino acid for glucose tolerance, substrate specificity and transglycosylation activity of metagenomic β-glucosidase Td2F2. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tomohiko Matsuzawa, Toshinori Jo, Taku Uchiyama, Jenny A Manninen, Takatoshi Arakawa, Kentaro Miyazaki, Shinya Fushinobu, Katsuro Yaoi
  • 雑誌名: FEBS Journal 巻: - 号: 12 ページ: 2340-2353
  • DOI: 10.1111/febs.13743
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] rystal structures of archaeal 2-oxoacid:ferredoxin oxidoreductases from Sulfolobus tokodaii (2016)
  • 著者名/発表者名: Z. Yan, A. Maruyama, T. Arakawa, S. Fushinobu, and T. Wakagi
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 6 号: 1 ページ: 33061-33061
  • DOI: 10.1038/srep33061
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 糖タンパク質糖鎖の加水分解酵素に関する研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤田清貴
  • 雑誌名: 応用糖質科学 巻: 6 ページ: 30-36
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Characterization of a β-L-Arabinopyranosidase from <i>Bifidobacterium longum</i> subsp. <i>longum</i> (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤田清貴ら
  • 雑誌名: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ 巻: 62 号: 1 ページ: 1-6
  • DOI: 10.5458/jag.jag.JAG-2014_006
  • NAID: 130004705329
  • ISSN: 1344-7882, 1880-7291
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Characterization and crystal structure determination of β-1,2-mannobiose phosphorylase from Listeria innocua (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Tsuda, T. Nihira, K. Chiku, E. Suzuki, T. Arakawa, M. Nishimoto, M. Kitaoka, H. Nakai, and S. Fushinobu
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 589 号: 24PartB ページ: 3816-3821
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2015.11.034
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal structure and substrate recognition of cellobionic acid phosphorylase, which plays a key role in oxidative cellulose degradation by microbes (2015)
  • 著者名/発表者名: Y.-W. Nam, T. Nihira, T. Arakawa, Y. Saito, M. Kitaoka, H. Nakai, and S. Fushinobu
  • 雑誌名: J. BIol. Chem. 巻: 290 号: 30 ページ: 18281-18292
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.664664
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] N-Glycosylation with Synthetic Undecaprenyl Pyrophosphate-Linked Oligosaccharide to Oligopeptides by PglB Oligosaccharyltransferase from Campylobacter jejuni (2015)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata A, Taguchi Y, Lee YJ, Watanabe T, Kohda D, Ito Y.
  • 雑誌名: Chembiochem 巻: 16 号: 5 ページ: 731-737
  • DOI: 10.1002/cbic.201402658
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Structural analysis of β-L-arabinofuranosidases in GH127 and GH146 (2019)
  • 著者名/発表者名: Shinya Fushinobu
  • 学会等名: 13th Carbohydrate Bioengineering Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural analysis for studying the reaction mechanism of β-L-arabinofuranosidases (2019)
  • 著者名/発表者名: Shinya Fushinobu
  • 学会等名: ACS Fall 2019 National Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] GH127 beta-L-アラビノフラノシダーゼ阻害剤の合成検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会
• [学会発表] N-(L-アラビノフラノシル) ハロアセトアミド両異性体の立体選択的合成 (2018)
  • 著者名/発表者名: 成田 覚、石渡 明弘、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本農芸化学会2018年度大会
• [学会発表] 結核菌アラビナン分解酵素の機能解析に向けたオリゴアラビノフラノシド誘導体の合成研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本農芸化学会2018年度大会
• [学会発表] 渦鞭毛藻由来 beta-1,5 結合した-L-アラビノフラノシド三糖構造の構築と構造解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本化学会第98春季年会
• [学会発表] Synthetic studies on L-arabinofuranosylated probes for bifidobacterial beta-L-arabinofuranosidase (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata, A.; Narita, S.; Kimura, K.; Fushinobu S.; Fujita K.; Ito, Y.
  • 学会等名: International Symposium on ER stress, glycosylation, homeostasis and diseases
  • 国際学会
• [学会発表] Bifidobacterium longum由来の beta-L-アラビノフラノシダーゼの機構解析に向けたアラビノフラノース構造を有するプローブの合成検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、成田 覚、藤田 清貴、伏信 進矢、伊藤 幸成
  • 学会等名: 第37回日本糖質学会年会
• [学会発表] Strategy toward the synthesis of glycoconjugate from plant and bacteria (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata, A.
  • 学会等名: ACS On Campus in AIST
  • 招待講演
• [学会発表] beta-L-アラビノフラノシダーゼの機能解析に向けたアラビノフラノース構造を有する阻害剤の合成検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、成田 覚、藤田 清貴、伏信 進矢、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成30年度大会
• [学会発表] Synthesis of the arabinan fragments of mycobacterial cell wall (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata, A.
  • 学会等名: 9th Asian Community of Glycoscience and Glycotechology Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Strategy toward the synthesis of glycoconjugate from plant and bacteria (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata, A.
  • 学会等名: Academia Sinica
• [学会発表] ビフィズス菌由来 beta-アラビノフラノシダーゼの基質及び阻害剤の立体選択的合成研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、成田 覚、伊藤 幸成
  • 学会等名: GlycoTokyo 2018
• [学会発表] B. longum JCM1217由来GH127 β-L-アラビノフラノシダーゼ (HypBA1)の機能構造解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 丸山 瞬、伊藤 佑、藤田 清貴、石渡 明弘、伊藤 幸成、荒川 孝俊、伏信 進矢
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 京都女子大（京都府 京都市）
  • 年月日: 2017-03-17
• [学会発表] 1,5-結合したβ-L-アラビノフラノシドを有するオリゴアラビノフラノシドの合成と構造解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 京都女子大（京都府 京都市）
  • 年月日: 2017-03-17
• [学会発表] Bifidobacterium longum subsp. longumのII型アラビノガラクタン分解酵素群の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤田 清貴、坂本 彩美、嵩下 愛果、東郷 奈未、北原 兼文
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
  • 発表場所: 京都女子大（京都府 京都市）
  • 年月日: 2017-03-17
• [学会発表] Xanthomonas属細菌由来β-L-アラビノフラノシダーゼの結晶構造 (2017)
  • 著者名/発表者名: 澤野 孝太, 丸山 瞬, 荒川 孝俊, 中村 正幸, 石渡 明弘, 伊藤 幸成, 藤田 清貴, 伏信 進矢
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会 (ConBio2017)
• [学会発表] β－L－アラビノフラノシドを有する植物由来オリゴアラビノフラノシドの合成と構造解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 石渡 明弘、伊藤 幸成
  • 学会等名: 日本化学会
  • 発表場所: 慶応大学日吉キャンパス（神奈川県 横浜市）
• [学会発表] β-1,3-結合に作用するβ-L-アラビノフラノシダ―ゼの機能解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤田 清貴、角町華子、石渡明弘、伊藤幸成、北原兼文
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会大会
  • 発表場所: 学校法人福山大学宮地茂記念館（広島県 福山市）
  • 年月日: 2016-09-14
• [学会発表] ビフィズス菌が腸内の糖質を分解するための酵素のかたちと動き (2016)
  • 著者名/発表者名: 伏信進矢
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会大会
  • 発表場所: 広島県民文化センターふくやま（広島県 福山市）
  • 年月日: 2016-09-14
  • 招待講演
• [学会発表] 糖タンパク質糖鎖の加水分解酵素に関する研究 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤田清貴
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成27年度大会
  • 発表場所: 奈良
  • 年月日: 2015-09-16
• [学会発表] βｰアラビノオリゴ糖鎖に作用するβ-L-アラビノフラノシダーゼの機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤田清貴、亀山恭平、下川倫子、伏信進矢、石渡明弘、Sophon Kaeothip、伊藤幸成、北原兼文
  • 学会等名: 第34回日本糖質学会年会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-07-31
• [備考] Bibliography of Shinya Fushinobu
  • URL: http://enzyme13.bt.a.u-tokyo.ac.jp/fushi/pub.html
• [備考] 石渡 明弘 Akihiro Ishiwata (Researchmap)
  • URL: https://researchmap.jp/a-ishiwata
• [備考] 藤田 清貴 (Kiyotaka Fujita) (Researchmap)
  • URL: https://researchmap.jp/read0201683