遺伝子組換え動物を用いた哺乳類生殖細胞特異的GPIアンカータンパク質の機能解析

• 研究課題/領域番号: 15H05573
• 研究種目: 若手研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 実験動物学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 藤原 祥高 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい准教授 (70578848)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 23,400千円 (直接経費: 18,000千円、間接経費: 5,400千円); 2018年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円); 2017年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円); 2016年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2015年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
• キーワード: 生殖細胞 / GPIアンカータンパク質 / 遺伝子組換えマウス / CRISPR/Cas9 / 受精 / 哺乳類生殖細胞 / CRISPR/cas9 / ゲノム編集 / 点変異 / 精子受精能 / CRISPR/Cas9システム / ES細胞 / CRISPR/Casシステム

研究成果の概要

不妊・不育は我が国の社会問題のひとつであるが、研究代表者はこれまで遺伝子組換え動物を用いて男性不妊の原因遺伝子を探索・解析してきた。本研究では、現在主流になった遺伝子改変技術CRISPR/Cas9により効率良く遺伝子組換え動物を作出し解析することで、生殖に必須な遺伝子を新たに見つけることに成功した。また、副プロジェクトとしてCRISPR/Cas9を駆使することで、点変異やノックインなどの従来難しかったゲノム編集を導入した動物の作製にも成功した。これらの技術は、ヒト遺伝性疾患のモデル動物作製に大いに役立つと考えられる。

研究成果の学術的意義や社会的意義

本研究では、新たなゲノム編集技術CRISPR/Cas9を駆使して遺伝子組換えマウスを効率良く作製・解析することで、哺乳類の生殖に必須な遺伝子を複数同定することに成功した。その中でも特筆すべきは、研究代表者がこれまで着目してきた生殖細胞特異的に発現する膜タンパク質の一種GPIアンカータンパク質を網羅的に解析した結果、LYPD4が精子受精能に関与する新たな因子であることを明らかにした。今回発見した因子の全てがヒトにも保存されていることから、男性不妊の診断マーカーや避妊薬開発のターゲットとしての可能性を秘めている。

研究成果

• [国際共同研究] Baylor College of Medicine(米国)
• [国際共同研究] Baylor College of Medicine(米国)
• [国際共同研究] Baylor College of Medicine(米国)
• [雑誌論文] Seminal vesicle secretory protein 7, PATE4, is not required for sperm function but for copulatory plug formation to ensure fecundity. (2019)
  • 著者名/発表者名: Noda T, Fujihara Y, Matsumura T, Oura S, Kobayashi S, Ikawa M.
  • 雑誌名: Biology of reproduction 巻: 印刷中 号: 4 ページ: 1035-1045
  • DOI: 10.1093/biolre/ioy247
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Co-expression of sperm membrane proteins CMTM2A and CMTM2B is essential for ADAM3 localization and male fertility in mice. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Y, Oji A, Kojima-Kita K, Larasati T, Ikawa M.
  • 雑誌名: Journal of cell science 巻: 131 ページ: 221481-221481
  • DOI: 10.1242/jcs.221481
  • NAID: 130007719285
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] mDia1/3 generate cortical F-actin meshwork in Sertoli cells that is continuous with contractile F-actin bundles and indispensable for spermatogenesis and male fertility. (2018)
  • 著者名/発表者名: S. Sakamoto, D. Thumkeo, H. Ohta, Z. Zhang, S.R. Huang, P. Kanchenawong, T. Fuu, S. Watanabe, K. Shimada, Y. Fujihara, S. Yoshida, M. Ikawa, N. Watanabe, M. Saitou and S. Narumiya
  • 雑誌名: Plos Biology 巻: 16 号: 9 ページ: e2004874-e2004874
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.2004874
  • NAID: 120006531249
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] MARCKSL1 regulates spine formation in the amygdala and controls the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and anxiety-like behaviors. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanaka T, Shimizu S, Ueno M, Fujihara Y, Ikawa M, Miyata S.
  • 雑誌名: EBioMedicine 巻: 30 ページ: 62-73
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2018.03.018
  • NAID: 120006957428
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Activation of Myofibroblast TRPA1 by Steroids and Pirfenidone Ameliorates Fibrosis in Experimental Crohn's Disease (2018)
  • 著者名/発表者名: Kurahara Lin Hai、Hiraishi Keizo、Hu Yaopeng、Koga Kaori、Onitsuka Miki、Doi Mayumi、Aoyagi Kunihiko、Takedatsu Hidetoshi、Kojima Daibo、Fujihara Yoshitaka、Jian Yuwen、Inoue Ryuji
  • 雑誌名: Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 巻: 5 号: 3 ページ: 299-318
  • DOI: 10.1016/j.jcmgh.2017.12.005
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Factors controlling sperm migration through the oviduct revealed by gene-modified mouse models (2018)
  • 著者名/発表者名: fujihara Y, Miyata H, Ikawa M.
  • 雑誌名: Experimental Animals 巻: 67 号: 2 ページ: 91-104
  • DOI: 10.1538/expanim.17-0153
  • NAID: 130006733631
  • ISSN: 0007-5124, 1341-1357, 1881-7122
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Regulation of inflammatory responses by dynamic subcellular localization of RNA-binding protein Arid5a (2018)
  • 著者名/発表者名: Higa M, Oka M, Fujihara Y, Masuda K, Yoneda Y, Kishimoto T.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 6:115(6) 号: 6
  • DOI: 10.1073/pnas.1719921115
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Human Globozoospermia-Related Gene Spata16 Is Required for Sperm Formation Revealed by CRISPR/Cas9-Mediated Mouse Models (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Yoshitaka、Oji Asami、Larasati Tamara、Kojima-Kita Kanako、Ikawa Masahito
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 18 号: 10 ページ: 2208-2208
  • DOI: 10.3390/ijms18102208
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] JunB is essential for IL-23-dependent pathogenicity of Th17 cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hasan Z, Koizumi SI, Sasaki D, Yamada H, Arakaki N, Fujihara Y, Okitsu S, Shirahata H, Ishikawa H.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 8 号: 1 ページ: 15628-15628
  • DOI: 10.1038/ncomms15628
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A chromosome 16p13.11 microduplication causes hyperactivity through dysregulation of miR-484/protocadherin-19 signaling. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fujitani, M., Zhang, S., Fujiki, R., Fujihara, Y. and Yamashita, T.
  • 雑誌名: Mol. Psychiatry 巻: 22 号: 3 ページ: 364-374
  • DOI: 10.1038/mp.2016.106
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A GPI processing phospholipase A2, PGAP6, modulates Nodal signaling in embryos by shedding CRIPTO. (2016)
  • 著者名/発表者名: Lee GH, Fujita M, Takaoka K, Murakami Y, Fujihara Y, Kanzawa N, Murakami KI, Kajikawa E, Takada Y, Saito K, Ikawa M, Hamada H, Maeda Y, Kinoshita T.
  • 雑誌名: The Journal of Cell Biology 巻: 215 ページ: 705-718
  • NAID: 120006957406
  • 査読あり
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Oji A, Noda T, Fujihara Y, Miyata H, Kim YJ, Muto M, Nozawa K, Matsumura T, Isotani A, Ikawa M.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 6 号: 1 ページ: 34666-34666
  • DOI: 10.1038/srep31666
  • NAID: 120006957419
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Live imaging of X chromosome reactivation dynamics in early mouse development can discriminate naive from primed pluripotent stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi S, Hosoi Y, Shiura H, Yamagata K, Takahashi S, Fujihara Y, Kohda T, Okabe M, Ishino F.
  • 雑誌名: Development 巻: 143 号: 16 ページ: 2958-2964
  • DOI: 10.1242/dev.136739
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural and functional insights into IZUMO1 recognition by JUNO in mammalian fertilization. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kato K, Satouh Y, Nishimasu H, Kurabayashi A, Morita J, Fujihara Y, Oji A, Ishitani R, Ikawa M, Nureki O.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 7 号: 1 ページ: 12198-12198
  • DOI: 10.1038/ncomms12198
  • NAID: 120006957420
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Genome engineering uncovers 54 evolutionarily conserved and testis-enriched genes that are not required for male fertility in mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyata H, Castaneda JM, Fujihara Y, Yu Z, Archambeault DR, Isotani A, Kiyozumi D, Kriseman ML, Mashiko D, Matsumura T, Matzuk RM, Mori M, Noda T, Oji A, Okabe M, Prunskaite-Hyyrylainen R, Ramirez-Solis R, Satouh Y, Zhang Q, Ikawa M, Matzuk MM.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 113 号: 28 ページ: 7704-7710
  • DOI: 10.1073/pnas.1608458113
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The Mg2+ transporter CNNM4 regulates sperm Ca2+ homeostasis and it is essential for reproduction (2016)
  • 著者名/発表者名: Daisuke Yamazaki, Haruhiko Miyata, Yosuke Funato, Yoshitaka Fujihara, Masahito Ikawa, Hiroaki Miki
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 未定 号: 9 ページ: 1940-1949
  • DOI: 10.1242/jcs.182220
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] GPI-AP release in cellular, developmental, and reproductive biology. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Y, Ikawa M.
  • 雑誌名: J Lipid Res. 巻: 57 号: 4 ページ: 538-545
  • DOI: 10.1194/jlr.r063032
  • NAID: 120006957424
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 生殖不全の表現型解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高，佐藤裕公，伊川正人
  • 雑誌名: 実験医学別冊マウス表現型解析スタンダード 巻: 1 ページ: 216-227
• [雑誌論文] Lentiviral Vector Mediated Complementation Restored Fetal Viability but Not Placental hyperplasia in Plac1-Deficient Mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Muto M, Fujihara Y, Tobita T, Kiyozumi D, Ikawa M.
  • 雑誌名: Biol Reprod. 巻: 94(1) 号: 1 ページ: 6-6
  • DOI: 10.1095/biolreprod.115.133454
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Sperm calcineurin inhibition prevents mouse fertility with implications for male contraceptive (2015)
  • 著者名/発表者名: Haruhiko Miyata, Yuhkoh Satouh, Daisuke Mashiko, Masanaga Muto, Kaori Nozawa, Kogiku Shiba, Yoshitaka Fujihara, Ayako Isotani, Kazuo Inaba, Masahito Ikawa
  • 雑誌名: Science 巻: 350 号: 6259 ページ: 442-445
  • DOI: 10.1126/science.aad0836
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Calreticulin is required for development of the cumulus oocyte complex and female fertility. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokuhiro K, Satouh Y, Nozawa K, Isotani A, Fujihara Y, Hirashima Y, Matsumura H, Takumi K, Miyano T, Okabe M, Benham AM, Ikawa M.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 5 号: 1 ページ: 14254-14254
  • DOI: 10.1038/srep14254
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Double strand break repair by capture of retrotransposon sequences and reverse-transcribed spliced mRNA sequences in mouse zygotes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ono R., Ishii M., Fujihara Y., Kitazawa M., Usami T., Kaneko-Ishino T., Kanno J., Ikawa M., Ishino F.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 号: 1 ページ: 12281-12281
  • DOI: 10.1038/srep12281
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 第II部第3章 マウスでのゲノム編集 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、伊川正人
  • 雑誌名: ゲノム編集成功の秘訣Q＆A 巻: 1 ページ: 106-123
• [学会発表] ゲノム編集動物作製法の開発と雄性不妊モデルマウスの機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤原 祥高
  • 学会等名: 第19回日本生殖工学会学術講演会
  • 招待講演
• [学会発表] Human globozoospermia-related gene Spata16 is required for sperm formation revealed by CRISPR/Cas9-mediated mouse models (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Asami Oji, Tamara Larasati, Kanako Kojima-Kita, and Masahito Ikawa
  • 学会等名: 66th Annual Meeting of the Society for Reproductive Investigation
  • 国際学会
• [学会発表] 遺伝子改変マウスを用いた精巣特異的Cmtm遺伝子群の機能解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤原 祥高、大字 亜沙美、北 加奈子、Tamara Larasati、伊川 正人
  • 学会等名: 第65回日本実験動物学会総会
• [学会発表] Human globozoospermia-related gene Spata16 is required for sperm formation revealed by CRISPR/Cas9-mediated mouse models (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Asami Oji, Tamara Larasati, Kanako Kojima-Kita, and Masahito Ikawa
  • 学会等名: 51st Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction
  • 国際学会
• [学会発表] Generation of point mutant mouse model responsible for human globozoospermia by CRISPR/Cas9 system (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Asami Oji, Kanako Kita, and Masahito Ikawa
  • 学会等名: 第64回日本実験動物学会総会
• [学会発表] 遺伝子改変技術を用いた雄性不妊モデルマウスの開発と機能解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高
  • 学会等名: 第64回日本実験動物学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 遺伝子改変マウスを用いた雄性生殖細胞特異的な膜タンパク質の機能解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高
  • 学会等名: 奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Human globozoospermia-related gene Spata16 is essential for spermiogenesis in mice (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Asami Oji, Tamara Larasati, Kanako Kojima-Kita and Masahito Ikawa
  • 学会等名: Fourth World Congress of Reproductive Biology
  • 国際学会
• [学会発表] 遺伝子改変技術を用いた雄性不妊モデルマウスの開発と機能解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高
  • 学会等名: 第14回熊本大学生命資源研究・支援センターシンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Human globozoospermia-related gene Spata16 is essential for spermiogenesis in mice (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Asami Oji, Tamara Larasati, Kanako Kojima-Kita and Masahito Ikawa
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（第40回日本分子生物学会年会）
• [学会発表] GPI-anchored protein complex, TEX101 and LY6K, is required for sperm fertilizing ability in mice (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Masaru Okabe, Masahito Ikawa
  • 学会等名: 国際シンポジウム "生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御"
  • 発表場所: 京都大学百周年時計台記念館
  • 年月日: 2016-02-17
  • 国際学会
• [学会発表] 雄性生殖細胞特異的 GPI アンカータンパク質の機能解析と新規遺伝子改変マウス作製法の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高
  • 学会等名: 神戸大学重点研究チーム「資源動物のシグナル伝達制御に関する研究」 ワークショップ 「生殖細胞研究の最先端技術」
  • 発表場所: 神戸大学農学研究科
  • 年月日: 2015-09-11
  • 招待講演
• [学会発表] GPI-anchored protein complex, LY6K/TEX101, is required for sperm fertilizing ability in mice (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Masaru Okabe, Masahito Ikawa
  • 学会等名: 第10回研究所ネットワーク国際シンポジウム
  • 発表場所: 北海道大学遺伝子病制御研究所
  • 年月日: 2015-07-23
  • 国際学会
• [学会発表] 雄性生殖細胞特異的な発現を示すGPIアンカータンパク質複合体LY6K/TEX101の精子受精能における役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、岡部勝、伊川正人
  • 学会等名: 第62回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 京都テルサ
  • 年月日: 2015-05-29
• [備考] researchmap
  • URL: https://researchmap.jp/Yoshitaka_Fujihara/
• [備考] ORCID
  • URL: https://orcid.org/0000-0001-8332-3507
• [備考] 大阪大学 研究者総覧
  • URL: http://www.dma.jim.osaka-u.ac.jp/view?l=ja&u=6639
• [備考] 大阪大学微生物病研究所 遺伝子機能解析分野 メンバー紹介ページ
  • URL: http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/information/yoshitaka_fujihara.html