構造情報に基づく脂質シグナル分子の認識機構の解明

• 研究課題/領域番号: 15J00102
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 森本 和志 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2015-04-24 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2017年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2016年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2015年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: PLA2 / プロスタグランジン / X線結晶構造解析 / EP3

研究実績の概要

ホスホリパーゼA2(PLA2)はリン脂質のsn-2位の脂肪酸を切断する酵素であり、様々な脂質群を基質とすることでアラキドン酸をはじめとする様々な脂肪酸およびリゾリン脂質を遊離する。PLA2の基質特異性は比較的緩やかであり、多様な基質を受容できる結合ポケットを持つことが推測される。
一方、PLA2によって産生された脂質群は代謝を受け、その一部はGタンパク質共役型受容体(GPCR)に作用することで作用を発揮する。例えばプロスタグランジン(PG)は計８種類のGPCRと結合することにより効果を発揮するが、EP受容体とDP受容体はケトン基(O)と水酸基(OH)の違いを見分けることが出来るほどその基質特異性は厳密である。
PLA2については予想以上に安定性が悪く発現が困難であったことから、本年度は進捗のあったPGE受容体EP3に集中して研究を進めることとした。EP3受容体については、昨年度までに昆虫細胞5 L培養分から約3 mgの精製タンパク質を得ることに成功していた。そこで本年度は、結晶化条件の検討およびコンストラクトの最適化を行うことにより結晶の取得を目指した。
GPCRの構造解析では、細胞内第3ループや細胞外N末端領域に融合タンパク質を挿入したり、立体構造認識抗体を結合させることで安定性および結晶性の向上が図られる。そこで、融合タンパク質の種類や挿入位置の最適化検討を行った。また、立体構造認識抗体を複数クローン樹立し、これらを用いた結晶化検討も平行して行った。その結果、最終的に分解能2.7 Aの回折データを得ることに成功した。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Hot-Spot Residues to be Mutated Common in G Protein-Coupled Receptors of Class A: Identification of Thermostabilizing Mutations Followed by Determination of Three-Dimensional Structures for Two Example Receptors. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yasuda S, Kajiwara Y, Toyoda Y, Morimoto K, Suno R, Iwata S, Kobayashi T, Murata T, Kinoshita M
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 巻: 121 号: 26 ページ: 6341-6350
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.7b02997
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] HOT-SPOT RESIDUES TO BE MUTATED COMMON IN G PROTEIN-COUPLED RECEPTORS OF CLASS A: IDENTIFICATION OF THERMOSTABILIZING MUTATIONS FOLLOWED BY DETERMINATION OF THREE-DIMENSIONAL STRUCTURES FOR TWO EXAMPLE RECEPTORS (2018)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Yasuda, Yuta Kajiwara, Yosuke Toyoda, Kazushi Morimoto, Ryoji Suno, So Iwata, Takuya Kobayashi, Takeshi Murata, Masahiro Kinoshita
  • 学会等名: 62nd Annual Meeting Biophysical Society
  • 国際学会
• [学会発表] シリルアリールトリフラート型のチエノベンザイン前駆体の合成と多置換ベンゾチオフェン合成への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 吉田優, 栗原ともこ, 森田隆太, 松澤翼, 森本和志, 小林拓也, 細谷孝充
  • 学会等名: 日本化学会 第98春季年会
• [学会発表] マスト細胞の炎症性応答に対するプロスタサイクリン受容体IPの抑制機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 宮本卓馬、鈴木佑治、渡辺真由帆、森本和志、村上里穂、稲住知明、土屋創健、成宮周、杉本幸彦
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
  • 発表場所: 仙台
• [学会発表] 抗体を用いたプロスタグランジン受容体のX線結晶構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 豊田洋輔、森本和志、寿野良二、関口雄介、山下恵太郎、平田邦夫、安田賢司、白石充典、堀田韻虹、浅田秀基、中根崇智、椎村祐樹、中北智哉、稲住知明、告恭史郎、梶原佑太、清水朋子、漆畑祐司、吉田 優、栗原ともこ、細谷孝充、木下正弘、杉本幸彦、野村紀通、村田武士、高山喜好、山本雅貴、成宮 周、岩田 想、小林拓也
  • 学会等名: 第13回GPCR研究会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-05-13
• [学会発表] IL-33によるマスト細胞の炎症性サイトカイン産生におけるプロスタサイクリン受容体IPの役割 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮本卓馬、鈴木佑治、渡辺真由帆、森本和志、稲住知明、土屋創健、成宮周、杉本幸彦
  • 学会等名: 日本薬学会 第136年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川・横浜)
  • 年月日: 2016-03-26
• [学会発表] プロスタノイドIP受容体によるマスト細胞の炎症性応答の抑制機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮本卓馬、鈴木佑治、渡辺真由帆、森本和志、土屋創健、成宮周、杉本幸彦
  • 学会等名: 平成28年度日本生化学会九州支部例会
  • 発表場所: 鹿児島
• [学会発表] マスト細胞の炎症性応答に対するプロスタサイクリン受容体IPの役割 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮本卓馬、鈴木佑治、渡辺真由帆、森本和志、土屋創健、成宮周、杉本幸彦
  • 学会等名: 第15回次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム
  • 発表場所: 大阪
• [学会発表] プロスタサイクリンIP受容体がマスト細胞炎症性応答に与える影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 村上里穂、宮本卓馬、鈴木佑治、渡辺真由帆、森本和志、稲住知明、土屋創健、成宮周、杉本幸彦
  • 学会等名: 第33回日本薬学会九州支部大会
  • 発表場所: 鹿児島
• [学会発表] IL-33誘導性マスト細胞応答におけるプロスタサイクリン受容体IPの役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 宮本 卓馬, 鈴木 佑治, 渡辺 真由帆, 森本 和志, 土屋 創健, 成宮 周, 杉本 幸彦
  • 学会等名: 第88回日本生化学会大会（BMB2015）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド(兵庫・神戸)
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] Towards structure determination of the human prostanoid receptor bound to the antibody. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yosuke Toyoda, Kazushi Morimoto, Ryoji Suno, Yusuke Sekiguchi, Keitaro Yamashita, Kunio Hirata, Satoshi Yasuda, Hidetsugu Asada, Takanori Nakane, Yuki Shiimura, Tomoya Nakagita, Tomoaki Inazumi, Kyoshiro Tsuge, Yuta Kajiwara, Tomoko Shimizu, Yuji Urushibata, Suguru Yoshida, Tomoko Kuribara, Takamitsu Hosoya et. al.
  • 学会等名: GPCR Workshop 2015
  • 発表場所: Hawaii(USA)
  • 年月日: 2015-12-01