乳歯歯髄由来ヒトｉＰＳ細胞からの歯髄幹細胞への分化誘導制御

• 研究課題/領域番号: 15J03924
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 矯正・小児系歯学
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 村上 智哉 新潟大学, 医歯学系, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2015-04-24 – 2017-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2016年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 2016年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2015年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 乳歯歯髄細胞 / LEF-1 / 乳歯歯髄幹細胞 / piggyBacトランスポゾン

研究実績の概要

LEF-1は、生物の発生に重要なwnt/β-cateninシグナルにおける転写因子であり、β-cateninを介してwnt標的遺伝子の転写に関わることがわかっている。また、iPS細胞を含めた幹細胞における未分化の維持・増殖に関与することも報告されている。そこで、LEF-1が歯髄幹細胞を含めた未分化な歯系細胞においてマーカーとなるのではと考え本研究においてプロモーターとして採用することとした。
本研究では、LEF-1プロモーターを配したプラスミドベクターとして、遺伝子導入効率が高いとされるpiggyBacトランスポゾン系を採用した。ヒトLEF-1プロモーター＋EGFP cDNA＋抗生物質耐性遺伝子（Neomycin）を挿入したプラスミドpTA-LENを作製した。pTA-LENを乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入行い、薬剤選択およびEGFP発現を指標とし、LEF-1発現細胞を取得し、幹細胞としての可能性について検討することを目的とした。
これまでの研究より、pTA-LENを乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入行い薬剤選択後、LEF-1発現細胞を採取することができた。
今年度は、これまでLEF-1発現細胞の神経系および骨系への分化誘導後の評価が不十分であったため、LEF-1発現細胞を分化誘導後にRT-PCR解析を行いmRNAレベルでの評価を行った。結果、代表的な神経芽細胞および骨芽細胞の分化マーカーが検出され、LEF-1発現細胞の多分化能が強く示唆された。加えて、乳歯歯髄細胞由来iPS細胞へpTA-LENを遺伝子導入行った。しかし、薬剤選択時に遺伝子組換えiPS細胞が薬剤耐性フィーダーごと剥がれてしまうことがあり、条件等を変更し培養方法等を検討してきた。薬剤耐性のLEF-1発現iPS細胞を単離することが現時点では十分に確立できておらず、培養方法等の検討を行っていく必要がある。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Isolation and characterization of lymphoid enhancer factor-1-positive deciduous dental pulp stem-like cells after transfection with a piggyBac vector containing LEF1 promoter-driven selection markers. (2017)
  • 著者名/発表者名: Murakami T, Saitoh I, Sato M, Inada E, Soda M, Oda M, Domon H, Iwase Y, Sawami T, Matsueda K, Terao Y, Ohshima H, Noguchi H, Hayasaki H
  • 雑誌名: Archives of Oral Biology 巻: 81 ページ: 110-120
  • DOI: 10.1016/j.archoralbio.2017.04.033
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Tissue-Specific Stem Cells Obtained by Reprogramming of Non-Obese Diabetic (NOD) Mouse-Derived Pancreatic Cells Confer Insulin Production in Response to Glucose. (2016)
  • 著者名/発表者名: Saitoh I, Sato M, Soda M, Inada E, Iwase Y, Murakami T, Ohshima H, Hayasaki H, Noguchi H.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: １１ 号: 9 ページ: e0163580-e0163580
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0163580
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Alkaline phosphatase and OCT-3/4 as useful markers for predicting susceptibility of human deciduous teeth-derived dental pulp cells to reprogramming factor-induced iPS cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Inada E, Saitoh I, Miura H, Ohtsuka M, Murakami T, Sawami T, Yamasaki Y, Watanabe S, Aoki R, Sato M
  • 雑誌名: Journal of Investigative and Clinical Dentistry 巻: - 号: 4 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1111/jicd.12236
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Choice of feeders is important when first establishing iPSCs derived from primarily cultured human deciduous tooth dental pulp cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Saitoh I, Inada E, Iwase Y, Noguchi H, Murakami T, Soda M, Kubota N, Hasegawa H, Akasaka E, Matsumoto Y, Oka K, Yamasaki Y, Hayasaki H, Sato M
  • 雑誌名: Cell Medicine 巻: 8 号: 1-2 ページ: 9-23
  • DOI: 10.3727/215517915x689038
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PiggyBac transposon-mediated gene delivery efficiently generates stable transfectants derived from cultured primary human deciduous tooth dental pulp cells (HDDPCs) and HDDPC-derived iPS cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Inada E, Saito I, Watanabe S, Aoki R, Miura H, Ohtsuka M, Murakami T, Sawami T, Yamasaki Y, Sato M
  • 雑誌名: International Journal of Oral Science 巻: 7 号: 3 ページ: 144-145
  • DOI: 10.1038/ijos.2015.18
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The genetic engineering-based isolation of lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF1) positive stem-like cells from human deciduous tooth cell-derived iPSCs (2016)
  • 著者名/発表者名: Murakami T, Saitoh I, Sato M, Inada E, Soda M, Iwase Y, Sawami T, Suzuki A, Ohshima H, Hayasaki H
  • 学会等名: 10th Biennial Conference of the Pediatric Dentistry Association of Asia
  • 発表場所: 東京ドームホテル(東京都文京区)
  • 年月日: 2016-05-26
• [学会発表] The Genetic Engineering-based Isolation of Lymphoid Enhancer-binding Factor-1 (LEF1) Positive Stem-like Cells from Human Deciduous Tooth Cell-derived iPSCs (2016)
  • 著者名/発表者名: 村上智哉
  • 学会等名: 10th Biennial Conference of the Pediatric Dentistry Association of Asia (PDAA)
  • 発表場所: 東京ドームホテル（東京都）
  • 年月日: 2016-05-26
• [学会発表] Genetic engineering-based isolation of deciduous dental pulp stem-like cells (2016)
  • 著者名/発表者名: 村上智哉
  • 学会等名: 45th Annual Meeting & Exhibition of the AADR
  • 発表場所: Los Angeles Convention (Los Angeles, Calif, USA)
  • 年月日: 2016-03-16
• [学会発表] Lymphoid enhancer factor-1 promoterを用いた乳歯歯髄幹細胞様細胞の単離. (2015)
  • 著者名/発表者名: 村上智哉
  • 学会等名: 新潟歯学会第2回例会
  • 発表場所: 新潟大学歯学部講堂 (新潟県・新潟市)
  • 年月日: 2015-11-07
• [備考] 新潟大学医歯学総合研究科小児歯科学分野ホームページ
  • URL: http://www.pediatric-dent.net/news/index.html#92