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PI3K-Akt-mTOR経路によるオートファジーと癌の制御機構の理解

研究課題

研究課題/領域番号 15J08117
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分国内
研究分野 腫瘍生物学
研究機関京都大学

研究代表者

小松原 晃  京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2015-04-24 – 2017-03-31
研究課題ステータス 完了 (2016年度)
配分額 *注記
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2016年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2015年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
キーワードFCS / ノックイン / Cas9 / 定量生物学 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / FCCS
研究実績の概要

本研究では、mTOR分子の活性制御について調べるため、蛍光タンパク質で内在性mTORや関連分子を標識し、PI3K-Akt-mTOR経路を定量的に解析、数理モデル化することを目指した。前年度までに、mEGFPノックイン細胞を樹立しており、これに対しFCSを用いることによって内在性タンパク質の定量が行えることを示した。これに基づき、mTORC2の構成因子であるRictorへのmEGFPノックインを行い、顕微鏡観察したところ細胞質に点状の局在が見られた。これは免疫染色で見られるものと一致していた。そこで、FCSを行ったところ、褪色の影響が大きく正しくパラメーターを得られなかった。これは、オルガネラ上に局在しているために拡散速度が非常に遅いためだと考えられた。このようなものへのFCSによる定量は適さないため、異なる方策を取る必要があった。
本研究の特性はノックインとFCSを用いて内在性分子の定量的解析を行う点にある、そこで、PI3K-Akt-mTORと密接に関連するEGFR-Ras-MEK-ERK-RSK経路の動向について調べることにした。このために、すでに樹立していたMAPK1(ERK2)-mEGFP細胞のRSK2遺伝子にHaloTag遺伝子をノックインし、EGFを投与した際のERK2とRSK2の相互作用についてFCCSで定量を行った。結果として、EGFによってERK2とRSK2の結合率が低下することがわかった。さらに、MEK阻害剤によって、投与前の結合率が上昇すること、EGFによる結合率低下を抑制できることがわかった。本研究により、ノックイン細胞とFCSを用いることによって、内在性分子の動的な相互作用の変化を観察することが示された。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2016 実績報告書
  • 2015 実績報告書
  • 研究成果

    (6件)

すべて 2017 2016 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer.2015

    • 著者名/発表者名
      Komatsubara AT, Matsuda M, Aoki K.
    • 雑誌名

      Scientific reports.

      巻: 5 号: 1 ページ: 17527-17527

    • DOI

      10.1038/srep13283

    • NAID

      120005672592

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Quantification of endogenous protein parameter by CRISPR/Cas9-mediated knock-in and fluorescence correlation spectroscopy2017

    • 著者名/発表者名
      小松原 晃
    • 学会等名
      The 1st ABiS Symposium Towards the Future of Advanced Bioimaging for Life Sciences
    • 発表場所
      岡崎カンファレンスセンター
    • 年月日
      2017-02-19
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] Quantification of endogenous protein concentration by CRISPR/Cas9-mediated knock-in and fluorescence correlation spectroscopy2016

    • 著者名/発表者名
      Akira Komatsubara
    • 学会等名
      Qbic symposium 2016
    • 発表場所
      千里ライフサイエンスセンター
    • 年月日
      2016-09-05
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] ゲノム編集技術を用いた内在性タンパク質の定量2016

    • 著者名/発表者名
      小松原 晃
    • 学会等名
      第68回細胞生物学会
    • 発表場所
      京都テルサ
    • 年月日
      2016-06-15
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] ゲノム編集による内在性タンパク質の標識と定量2016

    • 著者名/発表者名
      小松原晃
    • 学会等名
      生命動態の分子メカニズムと数理
    • 発表場所
      広島
    • 年月日
      2016-03-25
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
  • [学会発表] Quantitative analysis of recombination of FRET biosensors introduced by lentivirus or retrovirus2016

    • 著者名/発表者名
      Akira Komatsubara
    • 学会等名
      Winter q-bio 2016
    • 発表場所
      ハワイ
    • 年月日
      2016-02-17
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会

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公開日: 2015-11-26   更新日: 2024-03-26  

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