Ｇタンパク質共役型受容体のＧＲＫ／アレスチンを介したシグナル伝達制御機構の解明

• 研究課題/領域番号: 15J12409
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 白石 勇太郎 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2015-04-24 – 2017-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2016年度)
• 配分額: 2,630千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 330千円); 2016年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2015年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
• キーワード: NMR / アドレナリン受容体 / Gタンパク質共役型受容体キナーゼ / アレスチン / GRK / 区分同位体標識

研究実績の概要

イソロイシン側鎖δ1位メチル基を選択的に1H,13C標識し、その他を2H標識したβ-アレスチン1を大腸菌発現系より調製した。1H-13C HMQCスペクトルを測定し、観測されたシグナルを変異体を利用して帰属した。
rHDLに再構成したβ2ARをセンサーチップに固定化し、β-アレスチン1をアナライトとしたSPR解析により両者の親和性を決定した。その結果、βアレスチン1は、完全作動薬が結合し、かつC末端領域がリン酸化されているβ2AR変異体に対し強く結合する一方で、逆作動薬が結合している、もしくはリン酸化されていないβ2AR変異体に対しては親和性が弱いことが示された。以上の結果は、サイズ排除クロマトグラフィーによる相互作用解析の結果からも支持された。
β-アレスチン1に対して、完全作動薬もしくは逆作動薬が結合したリン酸化β2ARを添加した条件で1H-13C HMQCスペクトルを測定した。その結果、完全作動薬結合状態のリン酸化β2ARを添加した条件では多くのシグナルが線幅以上の化学シフト変化を示したのに対し、逆作動薬が結合したリン酸化β2ARを添加した条件では一部のシグナルに線幅程度の化学シフト変化が観測されるのみであった。以上の結果から、β-アレスチン1が活性化型構造へと構造変化するためには、TMドメインが活性化構造をとり、かつC末端領域がリン酸化されたGPCRと結合することが必要であることが示唆された。また、特に顕著な化学シフト変化を示した残基はNドメインとCドメインの境界面に分布していたことから、活性化に伴う構造変化は、両ドメインの相対配置の変化を伴うものであることが示唆された。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Development of a method for reconstruction of crowded NMR spectra from undersampled time-domain data (2015)
  • 著者名/発表者名: Ueda T, Yoshiura C, Matsumoto M, Kofuku Y, Okude J, Kondo K, Shiraishi Y, Takeuchi K, Shimada I
  • 雑誌名: J. Biomol. NMR 巻: 印刷中 号: 1 ページ: 31-41
  • DOI: 10.1007/s10858-015-9908-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Elucidation of the CCR1- and CCR5-binding modes of MIP-1α by application of an NMR spectra reconstruction method to the transferred cross-saturation experiments. (2015)
  • 著者名/発表者名: Chie Yoshiura, Takumi Ueda, Yutaka Kofuku, Masahiko Matsumoto, Junya Okude, Keita Kondo, Yutaro Shiraishi, Ichio Shimada
  • 雑誌名: Journal of Biomolecular NMR 巻: 63 号: 4 ページ: 333-340
  • DOI: 10.1007/s10858-015-9992-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of a Conformational Equilibrium That Determines the Efficacy and Functional Selectivity of the μ-Opioid Receptor. (2015)
  • 著者名/発表者名: Junya Okude, Takumi Ueda, Yutaka Kofuku, Motohiko Sato, Naoyuki Nobuyama, Keita Kondo, Yutaro Shiraishi, Takuya Mizumura, Kento Onishi, Mei Natsume, Masahiro Maeda, Hideki Tsujishita, Takefumi Kuranaga, Masayuki Inoue, Ichio Shimada
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 21 号: 52 ページ: 15771-15776
  • DOI: 10.1002/anie.201508794
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Identification of a Conformational Equilibrium That Determines the Efficacy and Functional Selectivity of the mu-Opioid Receptor (2017)
  • 著者名/発表者名: Yutaro Shiraishi, Junya Okude, Takumi Ueda, Yutaka Kofuku, Motohiko Sato, Naoyuki Nobuyama, Keita Kondo, Takuya Mizumura, Kento Onishi, Mei Natsume, Masahiro Maeda, Hideki Tsujishita, Takefumi Kuranaga, Masayuki Inoue, Ichio Shimada
  • 学会等名: 58th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • 発表場所: Pacific Groove, CA, USA
  • 年月日: 2017-03-26
  • 国際学会
• [学会発表] NMR analyses of the phosphorylation of β2-adrenergic receptor using segmental isotopic labeling (2015)
  • 著者名/発表者名: Yutaro Shiraishi, Yutaka Kofuku, Takumi Ueda, Mei Natsume, Hideo Iwai, Ichio Shimada
  • 学会等名: 第53回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学角間キャンパス自然科学本館(石川県金沢市)
  • 年月日: 2015-09-13
• [備考] 東京大学大学院薬学系研究科生命物理化学教室ホームページ
  • URL: http://ishimada.f.u-tokyo.ac.jp/public_html/