| 研究課題/領域番号 |
15J12476
|
|---|
| 研究種目 |
特別研究員奨励費
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 国内 |
|---|
| 研究分野 |
整形外科学
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
林 円香 東京大学, 大学院薬学系研究科, 特別研究員(DC2)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2017-03-31
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2016年度)
|
| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2016年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2015年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
|
|---|
| キーワード | IR/MAR法 / scFv三量体 / バイファンクショナル / 骨粗鬆症治療薬 / IgG2 / RANKL逆シグナル / 全長ヒトIgG2 / 親和性成熟 |
|---|
| 研究実績の概要 |
前年度取得した、in vitroでバイファンクショナルな活性を示す全長抗体IgG2安定的に高発現する細胞株を取得するため、IR-MAR法を用い、目的のプラスミドをCHO-DG44細胞に導入し、薬剤選抜を行うことで、目的遺伝子を高発現する細胞クローンを単離濃縮した。この細胞を一定期間培養した後、培地を回収し、proteinAビーズ、およびRANKL細胞外ドメインの組換タンパク質をカップリングさせたCNBrビーズを用いて精製し、抗体の組換タンパク質を取得した。
また、同様の活性を示すscFv三量体を用い、in vivoの検証を進めた。前年度のin vitroの検証により見出した、「RANKL逆シグナルは、骨芽細胞の分化前期を促進する一方、分化後期を抑制する」という知見に基づくと、生体での持続的なRANKL逆シグナル入力は、分化途上の未熟な骨芽細胞を蓄積させる一方、骨形成を担う分化後期の骨芽細胞の増加を抑制すると考えられる。そのため、RANKL逆シグナルを間欠的に入力することにより、シグナル入力期間中は初期の骨芽細胞が増加し、シグナルを解除すると、これらの骨芽細胞が成熟骨芽細胞、骨細胞にまで分化する可能性が推定された。そこで、野生型マウスにscFv三量体を5日間連続で腹腔内投与し、経時的に採血して骨代謝を反映する血清マーカーの変動を測定した。その結果、骨吸収マーカーであるTRAP5bが低下すると同時に、骨形成に関しては、初期骨芽細胞マーカーであるⅠ型コラーゲン-N-プロペプチド (P1NP) が上昇した一方、後期骨芽細胞マーカーであるGla化Osteocalcinは低下した。また、投与を停止し、RANKL逆シグナルの影響が解除されると、蓄積した初期の骨芽細胞の後期分化段階への移行が進み、Gla化Osteocalcinは上昇を示した。
以上の結果をまとめ、論文投稿準備中である。
|
| 現在までの達成度 (段落) |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
