耐熱型逆転写酵素の耐熱化機構の解明

• 研究課題/領域番号: 15K07388
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 保川 清 京都大学, 農学研究科, 教授 (30397559)
• 研究分担者: 兒島 憲二 京都大学, 農学研究科, 助教 (40542759)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円); 2017年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2016年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2015年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: リボヌクレアーゼH / RNase H / RNase H2 / 逆転写酵素 / GPMA method / CRISPR/Cas9システム / 変異原性 / MMLV RT / ゲノムプロフィリング法 / 耐熱化機構

研究成果の概要

RNase H は、RNA/DNAハイブリッドのRNAを塩基配列非特異的に加水分解する酵素である。RNase HはRNase H1 とRNase H2に大別される。レトロウイルスの逆転写酵素（RT）はDNA合成活性とRNase H活性をもつ。本研究では、RNase Hの機能の解明を目的として、①MMLV RTのRNase Hドメインを調製し、性状解析を行った。②ヒトRNase H2の活性と安定性に与える中性塩とpHの影響を解析した。③大腸菌の代わりにマウスNIH 3T3細胞株を用いたGPMA法を構築した。④RNase H2を欠損したNIH3T3細胞株を樹立し、その性質を検討した。

研究成果

• [国際共同研究] National Institutes of Health(米国)
• [国際共同研究] バンドン工科大学(インドネシア)
• [国際共同研究] National Institutes of Health(米国)
• [雑誌論文] Effects of neutral salts and pH on the activity and stability of human RNase H2 (2017)
  • 著者名/発表者名: Baba, M., Kojima, K., Nakase, R., Imai, S., Yamasaki, T., Takita, T., Crouch, R.J., Yasukawa, K.
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 印刷中 号: 3 ページ: 211-219
  • DOI: 10.1093/jb/mvx021
  • NAID: 40021326122
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] DNA-based mutation assay (GPMA) can be of ppb-order sensitivity for both bacterial and mammalian testers (2017)
  • 著者名/発表者名: Kumari, P., Gautam, S.G., Baba, M., Tsukiashi, M., Matsuoka, K., Yasukawa, K., Nishigaki, K.
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 162 号: 6 ページ: 395-401
  • DOI: 10.1093/jb/mvx043
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase variants using site saturation mutagenesis library and cell-free protein expression system (2017)
  • 著者名/発表者名: Katano, Y., Li, T., Baba, M., Nakamura, M., Ito, M., Kojima, K., Takita, T., Yasukawa, K.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 巻: 81 号: 12 ページ: 2339-2345
  • DOI: 10.1080/09168451.2017.1394790
  • 査読あり
• [雑誌論文] Further increase in thermostability of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by mutational combination (2017)
  • 著者名/発表者名: Baba, M., Kakue, R., Leucht, C., Rasor, P., Walch, H., Ladiges, D., Bell, C., Kojima, K., Takita, T., Yasukawa, K.
  • 雑誌名: Protein Eng. Des. Sel. 巻: 30 号: 8 ページ: 551-557
  • DOI: 10.1093/protein/gzx046
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Preparation and characterization of the RNase H domain of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (2015)
  • 著者名/発表者名: Nishimura, K., Yokokawa, K., Hisayoshi, T., Fukatsu, K., Kuze, I., Konishi, A., Mikami, B., Kojima, K., and Yasukawa, K.
  • 雑誌名: Protein Expression and Purification 巻: 113 ページ: 44-50
  • DOI: 10.1016/j.pep.2015.04.012
  • NAID: 120005668067
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Site saturation変異と無細胞タンパク質合成系を用いた耐熱化MMLV 逆転写酵素スクリーニング系の構築 (2017)
  • 著者名/発表者名: 李瞳陽、片野裕太、中村実世、馬場美聡、伊東昌章、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都女子大学
  • 年月日: 2017-03-17
• [学会発表] ヒトRNase H2の酵素活性と安定性に与える中性塩とpHの影響 (2017)
  • 著者名/発表者名: 馬場美聡，兒島憲二，中瀬理保子，今井翔太，山崎朋美，滝田禎亮，Robert J. Crouch，保川清
  • 学会等名: 第64回日本生化学会近畿支部例会
• [学会発表] 哺乳動物細胞を用いたGPMA（genome profiling-based mutation assay）法の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 馬場美聡、Parmila Kumari、Sunita Ghimire Gautam、月足元希、松岡浩司、西垣功一、保川清
  • 学会等名: 第46回日本環境変異原学会大会
• [学会発表] ヒトリボヌクレアーゼ H2の基質特異性の改変 (2017)
  • 著者名/発表者名: 兒島憲二，馬場美聡，杉浦拓也，西村拓人，滝田禎亮，Robert J. Crouch，保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会平成29年度関西支部大会（第500回講演会）
• [学会発表] 哺乳動物細胞を用いたゲノムプロフィリング法による変異原アッセイ法の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 馬場美聡、Parmila Kumari、Sunita Ghimire Gautam、月足元希、松岡浩司、西垣功一、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会平成29年度関西支部大会（第500回講演会）
• [学会発表] ヒトリボヌクレアーゼ H2の基質特異性の改変 (2017)
  • 著者名/発表者名: 兒島憲二，馬場美聡，杉浦拓也，西村拓人，滝田禎亮，Robert J. Crouch，保川清
  • 学会等名: 2017年度生命科学系合同年次大会
• [学会発表] 哺乳動物細胞を用いたGPMA (genome profiling-based mutation assay)法の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 馬場美聡、Parmila Kumari、Sunita Ghimire Gautam、月足元希、松岡浩司、西垣功一、保川清
  • 学会等名: 2017年度生命科学系合同年次大会
• [学会発表] マウス線維芽細胞株NIH3T3 RNase H2遺伝子欠損株の作製 (2017)
  • 著者名/発表者名: 月足元希、馬場美聡、兒島憲二、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 2017年度生命科学系合同年次大会
• [学会発表] 部位特異的変異導入によるヒトRNase H2の基質特異性の改変 (2017)
  • 著者名/発表者名: 兒島憲二，馬場美聡，西村拓人，杉浦拓也，滝田禎亮，上原了，Robert J. Crouch，保川清
  • 学会等名: ２０１８年度日本農芸化学会大会
• [学会発表] 変異の組み合わせによるモロニ―マウス白血病ウイルス逆転写酵素のさらなる耐熱化 (2017)
  • 著者名/発表者名: 馬場美聡, 角江亮太, Christoph Leucht, Peter Rasor, Heiko Walch, Daniel Ladiges, Christian Bell, 兒島憲二, 滝田禎亮, 保川清
  • 学会等名: ２０１８年度日本農芸化学会大会
• [学会発表] Effects of neutral salts on catalytic activity and stability of human RNase H2 (2016)
  • 著者名/発表者名: Kojima, K., Baba, M., Kojima, K., Nakase, R., Imai, S., Yamasaki, Crouch, R.J., T., Takita, T., Yasukawa, K.
  • 学会等名: RNaseH2016
  • 発表場所: 京都大学楽友会館
  • 年月日: 2016-09-06
  • 国際学会
• [学会発表] ヒトRNase H2の活性と安定性に対する塩の影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 兒島憲二、馬場美聡、中瀬理保子、今井翔太、山﨑朋美、Robert J. Crouch、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西支部第495回講演会
  • 発表場所: 大阪府立大学
• [学会発表] Nase H2の酵素化学的性質の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 馬場美聡、兒島憲二、中瀬理保子、今井翔太、山崎朋美、Robert J. Crouch、滝田禎亮、保川清
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西支部第496回講演会
  • 発表場所: 滋賀県立大学
• [学会発表] Effects of neutral salts and pH on catalytic activity of human RNase H2 (2016)
  • 著者名/発表者名: Baba, M., Kojima, K., Nakase, R., Imai, S., Yamasaki, T., Crouch, R.J., Takita, T.,Yasukawa, K.
  • 学会等名: JSBBA Student Forum
  • 発表場所: 神戸大学
• [学会発表] MMLV 逆転写酵素のRNase Hドメインの性状解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 横川貫太、西村耕作、深津浩佑、久世郁実、久好哲郎、小西篤、三上文三、兒島憲二、保川清
  • 学会等名: 第６２回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 立命館大学びわこ・くさつキャンパス
  • 年月日: 2015-05-16
• [図書] エッセンシャルタンパク質工学 (2018)
  • 著者名/発表者名: 老川典夫、大島敏久、保川清、三原久明、宮原郁子
  • 総ページ数: 210
  • 出版者: 講談社
  • ISBN: 9784061538993
• [備考] 酵素化学研究室ホームページ 業績
  • URL: http://www.enzchem.kais.kyoto-u.ac.jp/gyouseki.html