研究課題
基盤研究(C)
当該年度は研究対象の主たる、I型インターフェロン誘導性のコレステロール酸化酵素であるCH25hのテトラサイクリン誘導性発現細胞の作成を行った。作成対象の細胞株としては、実際にCH25hのI型インターフェロンによる誘導性の確認されている肺と肝臓であることから、まず肝細胞を由来とするHuh7を用いた。テトラサイクリン誘導性発現系の基盤としてインビトロジェン社のT-REx, Flp-inシステムを採用した。ヒトのCH25hのcDNAをOrigene社から入手し（pCMV6-CH25h）これをpcDNA5/FRT/TOへ導入した。Huh7細胞はpFRT/LacZeoにより形質転換細胞をゼオシン薬剤耐性により選択した。得られた形質転換細胞はガラクトシダーゼ発現細胞を組織染色することでKnock-in alleleの転写活性を評価して、転写強度の強い細胞株を選択した。細胞はさらにテトラサイクリンリプレッサー発現細胞に形質転換された。この際にはpcDNA6/TRを改良し、テトラサイクリンリプレッサーとBlasticidin deaminaseを融合タンパクとして発現させることで転写誘導のキレを向上させた。この細胞を用いて最終的にはFlp-in法によりCH25h遺伝子をテトラサイクリン誘導性に発現するHuh7細胞を得ることができた。現在はこの細胞株を用いてCH25hの産物25-Hydroxycholesterolの輸送系についてそのメカニズムの詳細を検討中である。またCH25h遺伝子のノックアウト細胞の作成に向けたベクターシステムの構築を行った。
すべて 2015
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (1件)
J Virol
巻: 89 号: 8 ページ: 4092-4101
10.1128/jvi.01653-14
