疾患バイオマーカーの高感度測定を支援する高性能変異抗体の効率的創製システム開発

• 研究課題/領域番号: 15K08629
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 病態検査学
• 研究機関: 神戸薬科大学
• 研究代表者: 小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
• 研究分担者: 大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (80572966) ; 森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20299085)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円); 2017年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2016年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円); 2015年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: 抗体 / 一本鎖Fvフラグメント / 変異体 / ライブラリー / 選択方法 / パンニング / 変異抗体 / バイオマーカー / 進化分子工学 / ファージ提示 / マイクロアレイ / デジタル検出

研究成果の概要

在来の診断用抗体の機能を遺伝子操作により改善することが可能と期待されている。抗体を一本鎖Fvフラグメント（scFv）に変換し、ランダム変異を加えた後にファージ粒子の表面に発現させて多様性に富むライブラリーを作製し、「パンニング」により希少な改良型分子種を選択・単離する。しかし、その選択効率に難があり、必ずしも好結果が得られない。そこで、ファージ産生菌をクローニングする新しい原理に基づく選択・単離法を開発した。コルチゾールに対するscFvの変異体ライブラリーを作製し、本法により高親和力変異体の単離を試みたところ、従来のパンニングからは得られなかった高親和力変異体が得られ、その有用性が示された。

研究成果

• [雑誌論文] A Single-Step “Breeding” Generated a Diagnostic Anti-cortisol Antibody Fragment with Over 30-Fold Enhanced Affinity (2017)
  • 著者名/発表者名: H. Oyama, I. Morita, Y. Kiguchi, T. Morishita, S. Fukushima, Y. Nishimori, T. Niwa, N. Kobayashi
  • 雑誌名: Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 巻: 40 号: 12 ページ: 2191-2198
  • DOI: 10.1248/bpb.b17-00633
  • NAID: 130006235440
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antibody Fragments for On-Site Testing of Cannabinoids Generated <i>via in Vitro</i> Affinity Maturation (2017)
  • 著者名/発表者名: Morita Izumi; Oyama Hiroyuki; Yasuo Mayumi; Matsuda Kazuhisa; Katagi Kengo; Ito Aya; Tatsuda Hiroka; Tanaka Hiroyuki; Morimoto Satoshi; Kobayashi Norihiro
  • 雑誌名: Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 巻: 40 号: 2 ページ: 174-181
  • DOI: 10.1248/bpb.b16-00669
  • NAID: 130005308428
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • 査読あり
• [雑誌論文] One-Shot In Vitro Evolution Generated an Antibody Fragment for Testing Urinary Cotinine with More Than 40-Fold Enhanced Affinity (2017)
  • 著者名/発表者名: Oyama, Hiroyuki; Morita, Izumi; Kiguchi, Yuki; Banzono, Erika; Ishii, Kasumi; Kubo, Satoshi; Watanabe, Yoshiro; Hirai, Anna; Kaede, Chiaki; Ohta, Mitsuhiro; Kobayashi Norihiro
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 89(1) 号: 1 ページ: 988-995
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.6b04332
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immunochemical Approach for Monitoring of Structural Transition of ApoA-I upon HDL Formation Using Novel Monoclonal Antibodies (2017)
  • 著者名/発表者名: H. Kimura, S. Mikawa, C. Mizuguchi, Y. Horie, I. Morita, H. Oyama, T. Ohgita, K. Nishitsuji, A. Takeuchi, S. Lund-Katz, K. Akaji, N. Kobayashi, H. Saito
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 7 号: 1 ページ: 2988-2988
  • DOI: 10.1038/s41598-017-03208-8
  • NAID: 120006534990
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Iowa Mutant Apolipoprotein A-I (ApoA-IIowa) Fibrils Target Lysosomes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kameyama H., Nakajima H., Nishitsuji K., Mikawa S., Uchimura K., Kobayashi N., Okuhira K., Saito H., and Sakashita N.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 6 号: 1 ページ: 30391-30391
  • DOI: 10.1038/srep30391
  • NAID: 120006534966
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate prevents apoA-IIowa amyloidosis in vitro and protects human embryonic kidney 293 cells against amyloid cytotoxicity. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakajima H, Nishitsuji K, Kawashima H, Kuwabara K, Mikawa S, Uchimura K, Akaji K, Kashiwada Y, Kobayashi N, Saito H, Sakashita N
  • 雑誌名: Amyloid 巻: 23 号: 1 ページ: 17-25
  • DOI: 10.3109/13506129.2015.1113167
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gaussia Luciferase as a Genetic Fusion Partner with Antibody Fragments for Sensitive Immunoassay Monitoring of Clinical Biomarkers (2015)
  • 著者名/発表者名: Oyama Hiroyuki; Morita Izumi; Kiguchi Yuki; Miyake Sayaka; Moriuchi Ayaka; Akisada Tatsuki; Kobayashi Norihiro; Niwa Toshifumi
  • 雑誌名: Analytical chemistry 巻: 87(24) 号: 24 ページ: 12387-12395
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two chalcones, 4-hydroxyderricin and xanthoangelol, stimulate GLUT4-dependent glucose uptake through the LKB1/AMP-activated protein kinase signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohta, Mitsuhiro; Fujinami, Aya; Kobayashi, Norihiro; Amano, Akiko; Ishigami, Akihito; Tokuda, Harukuni; Suzuki, Nobutaka; Ito, Fumitake; Mori, Taisuke; Sawada, Morio;
  • 雑誌名: Nutrition Research 巻: 35(7) 号: 7 ページ: 618-625
  • DOI: 10.1016/j.nutres.2015.05.010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cellular Interaction and Cytotoxicity of the Iowa Mutation of Apolipoprotein A-I (ApoA-IIowa) Amyloid Mediated by Sulfate Moieties of Heparan Sulfate (2015)
  • 著者名/発表者名: Kuwabara, K., Nishitsuji, K., Uchimura, K., Hung, S.C., Mizuguchi, M., Nakajima, H., Mikawa, S., Kobayashi, N., Saito, H., and Sakashita, N.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 290 号: 40 ページ: 24210-24221
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.652545
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Utility of Gaussia luciferase as a fusion partner with scFvs for bioluminescent immunoassays testing clinical biomarkers (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Oyama, Izumi Morita, Toshifumi Niwa, and Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 国際学会
• [学会発表] In vitro affinity maturation of a single-chain Fv fragment for on-site testing of cannabinoids (2017)
  • 著者名/発表者名: Izumi Morita, Hiroyuki Oyama, Hiroyuki Tanaka, Satoshi Morimoto, and Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 国際学会
• [学会発表] アッセイ感度の向上を目指す「抗体育種」：抗コチニン抗体を例として (2017)
  • 著者名/発表者名: 小林 典裕、大山 浩之、森田 いずみ、木口 裕貴
  • 学会等名: 日本法中毒学会第36年会
• [学会発表] 抗Δ9-テトラヒドロカンナビノール一本鎖Fvフラグメントの作製と試験管内親和性成熟 (2017)
  • 著者名/発表者名: 大山浩之, 森田いずみ, 松田和久, 片木謙吾, 小林典裕, 田中宏幸, 森元聡
  • 学会等名: 日本法中毒学会第36年会
• [学会発表] 新規モノクローナル抗ケタミン抗体の作製とその諸性質 (2017)
  • 著者名/発表者名: 森田いずみ, 神田結, 安尾まゆみ, 伊藤綾, 大山浩之, 小林典裕
  • 学会等名: 日本法中毒学会第36年会
• [学会発表] 高親和力を保持した抗エストラジオールscFv最少変異体調製の試み (2017)
  • 著者名/発表者名: 大山浩之, 木口裕貴, 井上由香莉, 高嶺百合子, 藤原若菜, 森田いずみ, 小林典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会66年会
• [学会発表] オンサイト免疫測定法を目的としたモノクローナル抗ケタミン抗体の新規調製 (2017)
  • 著者名/発表者名: 森田いずみ, 神田結, 安尾まゆみ, 伊藤綾, 大山浩之, 小林典裕:
  • 学会等名: 日本分析化学会66年会
• [学会発表] ApoA-I構造特異抗体の開発に向けた抗体評価系の確立 (2017)
  • 著者名/発表者名: 三河志穂、木村仁、森田いずみ、大山浩之、小林典裕、斎藤博幸
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
  • 発表場所: 仙台
• [学会発表] Effect of Heparin on Amyloid Fibril Formation of ApoA-I Fragment Peptides (2016)
  • 著者名/発表者名: Shiho Mikawa, Chiharu Mizuguchi, Izumi Morita, Hioryuki Oyama, Teruhiko Baba, Akira Shigenaga, Toshinori Shimanouchi, Norihiro Kobayashi, Akira Otaka, Kenichi Akaji, Hiroyuki Saito
  • 学会等名: 第53回ペプチド討論会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-10-26
• [学会発表] オンサイト分析を目的とする Teoc 化覚せいアミンに対するモノクローナル抗体の作製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 黒田 裕美, 森田 いずみ, 伊藤 綾, 小山 千尋, 池田 夏美, 大山 浩之, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 抗エストラジオールscFv 試験管内親和性成熟機構の解析（2） (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本 知佳, 大山 浩之, 木口 裕貴, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 高性能変異抗体の効率的単離を目的とする抗ファージ scFv-GLuc 融合体の調製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 木口 裕貴, 藤田 真聡, 片山 恵美子, 大山 浩之, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 抗コルチゾールscFv の親和性成熟における部位特異的点変異の効果 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之, 徳重 仁美, 知念 絵美理, 森下 知美, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] オンサイト免疫測定法を目的としたTeoc化覚せいアミンに対するモノクローナル抗体の新規調製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 森田いずみ、黒田裕美、伊藤綾、池田夏美、小山千尋、大山浩之、小林典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第65年会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 大麻成分の検出を目的とする抗Δ9-テトラヒドロカンナビノールscFvの試験管内親和性成熟 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大山浩之、森田いずみ、松田和久、伊藤綾、小林典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第65年会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 試験管内親和性成熟による実用抗体の創製：低分子バイオマーカーを例に (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之
  • 学会等名: 生物化学的測定研究会第20回学術シンポジウム
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-11-13
  • 招待講演
• [学会発表] 高親和力抗エストラジオール変異scFvの創製とその親和性成熟機構の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，江浪 友理，田川 達矢，山本 知佳，森田 いずみ，小林 典裕
  • 学会等名: 第55回日本臨床化学会年次学術集会
  • 発表場所: 吹田
  • 年月日: 2015-10-31
• [学会発表] 改良型抗エストラジオールscFvの親和性成熟機構の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，江浪 友理， 田川 達矢，山本 知佳，森田 いずみ，小林 典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第64年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2015-09-11
• [学会発表] scFv－ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いるチロキシン生物発光ELISAの試み (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，宮下 貴之，森田 いずみ，小林 典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第64年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2015-09-11
• [学会発表] Sensitive luminescent ELISA for human serum cortisol using a fusion protein combining anti-cortisol scFv and Gaussia lusiferase (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Oyama, Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 発表場所: paris
  • 年月日: 2015-06-22
  • 国際学会
• [学会発表] "Antibody breeding" for more sensitive immunoassays 1: Three-step affinity maturarion generated an improved scFv suitable for serum estradiol-17 beta ELISA (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Oyama, Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 発表場所: paris
  • 年月日: 2015-06-22
  • 国際学会
• [学会発表] "Antibody breeding" for more sensitive immunoassays 2: Human urinary cotinine ELISA using an affinity matured scFv to monitor tabacco smoke exposure (2015)
  • 著者名/発表者名: Izumi Morita, Hiroyuki Oyama, Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 発表場所: paris
  • 年月日: 2015-06-22
  • 国際学会
• [図書] 免疫測定法 基礎から先端まで (2015)
  • 著者名/発表者名: 生物化学測定研究会 編
  • 総ページ数: 325
  • 出版者: 講談社
• [備考] 神戸薬科大学 生命分析化学研究室
  • URL: http://www.kobepharma-u.ac.jp/analchem/