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次世代型標的遺伝子破壊法CRISPR/Cas9システムの歯学領域への応用

研究課題

研究課題/領域番号 15K11362
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
研究分野 矯正・小児系歯学
研究機関新潟大学

研究代表者

鹿児島 暁子  新潟大学, 医歯学総合病院, 医員 (50727584)

研究分担者 佐藤 正宏  鹿児島大学, 医療ミニブタ先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
稲田 絵美  鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568)
野口 洋文  琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
齊藤 一誠  新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2017-03-31
研究課題ステータス 中途終了 (2016年度)
配分額 *注記
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2017年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2016年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2015年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
キーワードCRIPR/Cas9システム / DSPP遺伝子 / CRISPR/Cas9システム / pCXLE-pac / RedCasDSPPni
研究実績の概要

本研究の目的は、歯の形成不全の発生機序の解明のために、次世代ノックアウト(KO)技法を用い、乳歯髄細胞内の標的遺伝子を効率的に破壊し、歯構成細胞への分化誘導後の細胞の機能を検討することである。
そこで、まずは次世代型KO技法である、CRIPR/Cas9システムの動作確認のために、α-1, 3-GalactosyltransferaaseをKOしたブタ胎児線維芽細胞を作製したところ、薬物耐性を有するKO細胞株の樹立が可能であった。
また、pCGsap1/DSPP, pTrans, pT-EGFP, pT-Hyg発現ベクターを作製し、乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入を行ったところ、20%程度の遺伝子導入株を確認することができた。
さらに、Cas9とdentin sialophosphoprotein(Dspp)遺伝子を標的としたguide RNAを同時に発現するベクターと、Hygromycin B耐性遺伝子発現ベクターと、EGFP蛍光遺伝子発現ベクターを、electroporation systemを用いて、歯髄細胞に共遺伝子導入した。1回目の実験では、遺伝子導入後の細胞をHygromycin Bでセレクションした後、濃縮株についてゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。続いて2回目の実験を行い、CRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子上の変異誘導効果について検討した。

報告書

(2件)
  • 2016 実績報告書
  • 2015 実施状況報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] Generation of α-1,3-galactosyltransferase-deficient porcine embryonic fibroblasts by CRISPR/Cas9-mediated knock-in of a small mutated sequence and a targeted toxin-based selection system.2015

    • 著者名/発表者名
      Sato M, Kagoshima A, Saitoh I, Inada E, Miyoshi K, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
    • 雑誌名

      Domestic Animal Reproduction

      巻: 50 号: 5 ページ: 872-880

    • DOI

      10.1111/rda.12565

    • 関連する報告書
      2015 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Evidence Based Dentistry in Pediatric Dentistry(8)外傷による乳歯完全脱臼への対応2016

    • 著者名/発表者名
      鹿児島暁子,中村 由紀,近藤 淳子,澤味 規,岩瀬 陽子,大島 邦子,齊藤 一誠,早﨑 治明
    • 学会等名
      第34回日本小児歯科学会北日本地方会大会
    • 発表場所
      日本歯科大学新潟生命歯学部(新潟市)
    • 年月日
      2016-10-09
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] ALP as a reliable marker for predicting early reprogramming.2016

    • 著者名/発表者名
      Miki Soda, Issei Saitoh, Emi Inada, Tomoya Murakami, Ayako Suzuki, Tadashi Sawami, Akiko Kagoshima, Yoko Iwase, Yutaka Terao , Hayato Ohshima, Haruaki Hayasaki, Masahiro Sato
    • 学会等名
      45rd Annual Meeting & Exhibition of the AADR/ 40h Annual Meeting of the CADR, Los Angeles, CA, USA, 2015.3.16-19.
    • 発表場所
      Los Angeles, CA, (USA)
    • 年月日
      2016-03-16
    • 関連する報告書
      2015 実施状況報告書
    • 国際学会

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公開日: 2015-04-16   更新日: 2018-01-16  

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