ゲノム編集ツールを用いたオンデマンド変異動物作製法の開発

• 研究課題/領域番号: 15K14366
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 実験動物学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 藤原 祥高 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (70578848)
• 連携研究者: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2015年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
• キーワード: ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / マウスES細胞 / ノックイン / CRISPR/Casシステム / 遺伝子組換えマウス / ES細胞 / 点変異

研究成果の概要

新たなゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムは、簡便かつ高効率に遺伝子改変動物を作製することができる。本課題では、単純な遺伝子破壊ではなく、点変異やノックインなどのより高度なゲノム編集を試みた。
まず、受精卵注入法で試みたところ、0.1kb以下のノックインは効率良く導入できたが、それ以上のノックインはうまくいかなかった。つまり、受精卵注入法でのノックイン効率は、導入カセットの大きさに依存して低下することが分かった。次に、相同組換え効率が高いマウスES細胞を用いたところ、一本鎖オリゴDNAよりも二本鎖DNAの方がはるかに効率良く、そして両アリルへ目的変異を導入できた。

研究成果

• [雑誌論文] Lentiviral Vector Mediated Complementation Restored Fetal Viability but Not Placental hyperplasia in Plac1-Deficient Mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Muto M, Fujihara Y, Tobita T, Kiyozumi D, Ikawa M.
  • 雑誌名: Biol Reprod. 巻: 94(1) 号: 1 ページ: 6-6
  • DOI: 10.1095/biolreprod.115.133454
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Sperm calcineurin inhibition prevents mouse fertility with implications for male contraceptive (2015)
  • 著者名/発表者名: Haruhiko Miyata, Yuhkoh Satouh, Daisuke Mashiko, Masanaga Muto, Kaori Nozawa, Kogiku Shiba, Yoshitaka Fujihara, Ayako Isotani, Kazuo Inaba, Masahito Ikawa
  • 雑誌名: Science 巻: 350 号: 6259 ページ: 442-445
  • DOI: 10.1126/science.aad0836
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Calreticulin is required for development of the cumulus oocyte complex and female fertility. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokuhiro K, Satouh Y, Nozawa K, Isotani A, Fujihara Y, Hirashima Y, Matsumura H, Takumi K, Miyano T, Okabe M, Benham AM, Ikawa M.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 5 号: 1 ページ: 14254-14254
  • DOI: 10.1038/srep14254
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Double strand break repair by capture of retrotransposon sequences and reverse-transcribed spliced mRNA sequences in mouse zygotes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ono R., Ishii M., Fujihara Y., Kitazawa M., Usami T., Kaneko-Ishino T., Kanno J., Ikawa M., Ishino F.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 号: 1 ページ: 12281-12281
  • DOI: 10.1038/srep12281
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 第II部第3章 マウスでのゲノム編集 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、伊川正人
  • 雑誌名: ゲノム編集成功の秘訣Q＆A 巻: 1 ページ: 106-123
• [学会発表] GPI-anchored protein complex, TEX101 and LY6K, is required for sperm fertilizing ability in mice (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Masaru Okabe, Masahito Ikawa
  • 学会等名: 国際シンポジウム "生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御"
  • 発表場所: 京都大学百周年時計台記念館
  • 年月日: 2016-02-17
  • 国際学会
• [学会発表] 雄性生殖細胞特異的 GPI アンカータンパク質の機能解析と新規遺伝子改変マウス作製法の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、伊川正人
  • 学会等名: 神戸大学重点研究チーム「資源動物のシグナル伝達制御に関する研究」 ワークショップ 「生殖細胞研究の最先端技術」
  • 発表場所: 神戸大学農学研究科
  • 年月日: 2015-09-11
  • 招待講演
• [学会発表] GPI-anchored protein complex, LY6K/TEX101, is required for sperm fertilizing ability in mice (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Masaru Okabe, Masahito Ikawa
  • 学会等名: 第10回研究所ネットワーク国際シンポジウム
  • 発表場所: 北海道大学遺伝子病制御研究所
  • 年月日: 2015-07-23
  • 国際学会
• [学会発表] 雄性生殖細胞特異的な発現を示すGPIアンカータンパク質複合体LY6K/TEX101の精子受精能における役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、岡部勝、伊川正人
  • 学会等名: 第62回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 京都テルサ
  • 年月日: 2015-05-28
• [備考] 大阪大学 研究者総覧
  • URL: http://www.dma.jim.osaka-u.ac.jp/view?l=ja&u=6639
• [備考] 大阪大学微生物病研究所 遺伝子機能解析分野 メンバー紹介ページ
  • URL: http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/information/yoshitaka_fujihara.html