観るだけでわかるタンパク質間相互作用のハイスループット解析法の開発

• 研究課題/領域番号: 15K14456
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科, 教授 (40192679)
• 連携研究者: 加藤 洋平 京都大学, 大学院薬学研究科, 助教 (90568172)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2016年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2016年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円); 2015年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: タンパク質間相互作用 / GFP / Nanobody / 繊毛内タンパク質輸送複合体 / マイクロプレート / ポリスチレン親和性タグ

研究成果の概要

本研究では、独自に開発した『観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法（VIPアッセイ）』に関して、マイクロプレート上でのアッセイが可能になるように改良を加えた。
まず、抗GFP-Nanobodyを通常のポリスチレン（PS）製マイクロプレートに吸着させる方法では、十分な感度が得られなかった。次に、PS親和性ペプチドタグを抗GFP-Nanobodyに付加し、親水性PSプレートに吸着させたが、まだ十分な検出感度が得られなかったことから、さらにELISAを行い、二次抗体、三次抗体の濃度などの条件を検討することによって実用化可能な程度までの感度を得ることができた。

研究成果

• [雑誌論文] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by the Joubert syndrome proteins ARL13B and INPP5E. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nozaki S, Katoh Y, Terada M, Michisaka S, Funabashi T, Takahashi S, Kontani K, Nakayama K.
  • 雑誌名: J. Cell. Sci. 巻: 130 号: 3 ページ: 563-576
  • DOI: 10.1242/jcs.197004
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Intraflagellar transport-A complex mediates ciliary entry and retrograde trafficking of ciliary G protein-coupled receptors (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirano T, Katoh Y, Nakayama K
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 28 号: 3 ページ: 429-439
  • DOI: 10.1091/mbc.e16-11-0813
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Ciliary entry of KIF17 is dependent on its binding to the IFT-B complex via IFT46-IFT56 as well as on its nuclear localization signal (2017)
  • 著者名/発表者名: Funabashi T, Katoh Y, Michisaka S, Terada M, Sugawa M, Nakayama K
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 28 号: 5 ページ: 624-633
  • DOI: 10.1091/mbc.e16-09-0648
  • NAID: 120005997941
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Practical method for targeted disruption of cilia-related genes by using CRISPR/Cas9-mediated, homology-independent knock-in system (2017)
  • 著者名/発表者名: Katoh Y, Michisaka S, Nozaki S, Funabashi T, Hirano T, Takei R, Nakayama K.
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 28 号: 7 ページ: 898-906
  • DOI: 10.1091/mbc.e17-01-0051
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Overall architecture of the intraflagellar transport (IFT)-B complex containing Cluap1/IFT38 as an essential component of the IFT-B peripheral subcomplex. (2016)
  • 著者名/発表者名: Katoh Y, Terada M, Nishijima Y, Takei R, Nozaki S, Hamada H, Nakayama K
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 巻: 291 号: 21 ページ: 10962-10975
  • DOI: 10.1074/jbc.m116.713883
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Alteration of transbilayer phospholipid compositions is involved in cell adhesion, cell spreading, and focal adhesion formation (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyano R, Matsumoto T, Takatsu H, Nakayama K, Shin HW
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 590 号: 14 ページ: 2138-2145
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12247
  • NAID: 120007159976
  • 査読あり
• [雑誌論文] The phospholipid flippase ATP9A is required for the recycling pathway from the endosomes to the plasma membrane (2016)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y, Ono N, Shima T, Tanaka G, Katoh Y, Nakayama K, Takatsu H, Shin HW
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 27 号: 24 ページ: 3883-3893
  • DOI: 10.1091/mbc.e16-08-0586
  • NAID: 120005997942
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Modulation of primary cilia length by melanin-concentrating hormone receptor 1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Hamamoto A, Yamato S, Katoh Y, Nakayama K, Yoshimura K, Takeda S, Kobayashi Y, *Saito Y
  • 雑誌名: Cellular Signalling 巻: 28 号: 6 ページ: 572
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2016.02.018
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Class I Arfs (Arf1 and Arf3) and Arf6 are localized to the Flemming body and play important roles in cytokinesis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hanai, A., Ohgi, M., Yagi, C., Ueda, T., Shin, H.-W., and Nakayama, K.
  • 雑誌名: Journal of Biochemistry 巻: 159 号: 2 ページ: 201-208
  • DOI: 10.1093/jb/mvv088
  • 査読あり
• [雑誌論文] Modulation of ciliary length by melanin-concentrating hormone receptor 1. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hamamoto, A., Yamato, S., Katoh, Y., Nakayama, K., Yoshimura, K., Takeda, S.,
  • 雑誌名: Cell. Signal. 巻: 28 ページ: 572-584
  • 査読あり
• [雑誌論文] GM130 is a parallel tetramer with a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed (I-shaped) conformations. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ishida R, Yamamoto A, Nakayama K, Sohda M, Misumi Y, Yasunaga T, Nakamura N.
  • 雑誌名: FEBS J. 巻: 印刷中 号: 11 ページ: 2232-2244
  • DOI: 10.1111/febs.13271
  • 査読あり
• [雑誌論文] Architectures of multisubunit complexes revealed by a visible immunoprecipitation assay using fluorescent fusion proteins. (2015)
  • 著者名/発表者名: Katoh Y, Nozaki S, Hartanto D, Miyano R, Nakayama K
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 128 号: 12 ページ: 2351-2362
  • DOI: 10.1242/jcs.168740
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phospholipid flippase ATP10A translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2015)
  • 著者名/発表者名: Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K., and Shin, H.-W.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 290 号: 24 ページ: 15004-15017
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.655191
  • NAID: 120005690225
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] SNAP23/25 and VAMP2 mediate exocytic event of transferrin receptor-containing recycling vesicles. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kubo K, Kobayashi M, Nozaki S, Yagi C, Hatsuzawa K, Katoh Y, Shin HW, Takahashi S, Nakayama K
  • 雑誌名: Biology Open 巻: 4 号: 7 ページ: 910-920
  • DOI: 10.1242/bio.012146
  • NAID: 120005997718
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] COPI-mediated retrieval of SCAP is critical for regulating lipogenesis under basal and sterol-deficient conditions. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takashima, K., Saitoh, A., Funabashi, T., Hirose, S., Yagi, C., Nozaki, S., Sato, R., Shin, H.-W., and Nakayama, K.
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 128 ページ: 2805-2815
  • DOI: 10.1242/jcs.164137
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP11C mutation is responsible for the defect in phosphatidylserine uptake in UPS-1 cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takada, N., Takatsu, H., Miyano, R., Nakayama, K., and Shin, H.-W.
  • 雑誌名: Jounal of Lipid Research 巻: 56 号: 11 ページ: 2151-2157
  • DOI: 10.1194/jlr.m062547
  • NAID: 120005707794
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Phospholipid flippase ATP10A, a me mber of type IV P-type ATPases, translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2016)
  • 著者名/発表者名: Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • 学会等名: 2016 ASCB Annu al Meeting.
  • 発表場所: San Francisco, California, USA,
  • 年月日: 2016-12-03
  • 国際学会
• [学会発表] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by Joubert syndrome proteins Arl13b and INPP5E. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nozaki, S., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • 学会等名: 2016 ASCB Annu al Meeting.
  • 発表場所: San Francisco, California, USA,
  • 年月日: 2016-12-03
  • 国際学会
• [学会発表] Arl13b-dependant localization of INPP5E within cilia maintains ciliary r etrograde protein trafficking. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nozaki, S., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • 学会等名: The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-11-27
  • 国際学会
• [学会発表] Overall architecture of the intraflagellar transport (IFT)-B complex rev ealed by a visible immunoprecipitation assay. (2016)
  • 著者名/発表者名: Katoh, Y., Terada, M. & Nakayama, K.
  • 学会等名: he 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Dir ections”
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-11-27
  • 国際学会
• [学会発表] Differential roles of KIF17 and heterotrimeric kinesin-II interacting with the IFT-B complex in biogenesis of primary cilia. (2016)
  • 著者名/発表者名: Funabashi, T., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • 学会等名: The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”.
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-11-27
  • 国際学会
• [学会発表] IFT-A複合体と相互作用するC11orf74の繊毛内タンパク質輸送における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 高原万梨子、平野友章、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第89回日 本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25
• [学会発表] キネシン2とIFT複合体の相互作用の様式の解明と繊毛形成における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第89回日 本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25
• [学会発表] P4-ATPaseによるリン脂質フリップが膜変形に与える影響． (2016)
  • 著者名/発表者名: 高田直人、中山和久、申 惠媛
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25
• [学会発表] リン脂質フリッパーゼATP11CのPKCによる制御機構． (2016)
  • 著者名/発表者名: 高津宏之、高山真裕、中山和久、申 惠媛
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25
• [学会発表] ジュベール症候群原因遺伝子産物Arl13bによって制御される繊毛内タンパク質輸送の分子機構． (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、野崎梢平、中山和久
  • 学会等名: 第 89回日本生化学会大会シンポジウム「Arfファミリー低分子量Gタンパク質群が介在する多彩な生理機能と関連疾患」
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25
  • 招待講演
• [学会発表] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-09-10
• [学会発表] 繊毛内タンパク質の輸送を担うIFT-A複合体の構築様式と機能の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 平野友章、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-09-10
• [学会発表] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2-Cep19-FOPの機能の解析． (2016)
  • 著者名/発表者名: 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-09-10
• [学会発表] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-16
• [学会発表] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Aの構築様式と機能の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 平野友章、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] KIF17とIFT複合体の相互作用様式の解明と繊毛形成における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] 観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」を活用した繊毛内タンパク質輸送複合体 IFT-Bの構築様式の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、寺田将也、野崎梢平
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] Trafficking Machineries within Cilia: Arc hitectures and Functions of the IFT-A and IFT-B complexes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, K., Katoh, Y., Terada, T., Nozaki, S., Hirano, T. & Funabashi, T.
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会シンポジウム「高次生命機能を司るメンブレ ントラフィック：分子基盤からその破綻による疾患発症の理解に向けて」
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
  • 招待講演
• [学会発表] 「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」の開発と繊毛内タンパク質輸送複合体 IFT-B の 構築様式の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、寺田将也、中山和久
  • 学会等名: 第63回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-05-21
• [学会発表] KIF17 と IFT 複合体の相互作用様式の解明と繊毛内輸送における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第63回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-05-21
• [学会発表] ホスファチジルセリン取り込み異常のCHO-K1変異株（UPS-1）におけるflippaseの発現解析． (2015)
  • 著者名/発表者名: 高田直人、高津宏之、宮野吏永、中山和久、申惠媛
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式とCLUAP1の機能の解明． (2015)
  • 著者名/発表者名: 寺田将也、加藤洋平、野崎梢平、武井領汰、中山和久
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2とCep19の機能の解析． (2015)
  • 著者名/発表者名: 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体から小胞体への逆行輸送による (2015)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申惠媛、中山和久
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [学会発表] Visible immunoprecipitation（VIP）アッセイによるExocyst複合体の構築様式の解明． (2015)
  • 著者名/発表者名: 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-09-12
• [学会発表] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体-小胞体間の逆行輸送による脂質代謝調節． (2015)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申 惠媛、中山和久
  • 学会等名: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-09-12
• [学会発表] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性および細胞膜ダイナ ミクスへの関与 (2015)
  • 著者名/発表者名: 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申 惠媛
  • 学会等名: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-09-12
• [学会発表] Architectures of the BBSome, IFT-B, and Exocyst Complexes Revealed by Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay Using Fluorescent Fusion Proteins. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, K., Katoh, Y., Nozaki, S., & Terada, M.
  • 学会等名: FASEB Science Research Conference, “Biology o f Cilia and Flagella”
  • 発表場所: Snowmass Village, Colorado,
  • 年月日: 2015-07-19
  • 国際学会
• [学会発表] Visible immunoprecipitation (VIP) アッセイによるマルチサブユニット複合体の構築様式の解明 (2015)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、野崎梢平、寺田将也、中山和久
  • 学会等名: 第67回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-06-30
• [学会発表] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性及び細胞膜ダイナミクスへの関与． (2015)
  • 著者名/発表者名: 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申惠媛
  • 学会等名: 第62回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 草津
  • 年月日: 2015-05-16