| 研究課題/領域番号 |
15K15189
|
|---|
| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 研究分野 |
病態検査学
|
|---|
| 研究機関 | 群馬大学 |
|---|
研究代表者 |
龍城 真衣子 群馬大学, 医学部附属病院, 医員 (10751852)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| 研究課題ステータス |
中途終了 (2016年度)
|
| 配分額 *注記 |
3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2017年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2016年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2015年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
|
|---|
| キーワード | 腸管上皮細胞 / 末梢血単核球細胞 / 共培養 / 腸内細菌 / CACO-2 |
|---|
| 研究実績の概要 |
クローン病は、遺伝因子、環境因子、腸内細菌叢、免疫異常、エピジェネティクス異常が複雑に絡み合って発症する原因不明の疾患である。本研究では、患者由来の末梢血単核球細胞と腸管上皮細胞株との共培養法に、さらに腸内細菌を添加するという、新しい実験系を確立することを目的とする。この実験系により、よりin Vivoに近い状態で、腸内細菌に対する患者免細胞の免疫反応を解析することを可能とし、クローン病の病因解明に迫ることを目的とする。
方法は、（１）腸管上皮細胞モデルの作成、（２）腸管上皮細胞モデルの評価方法の確立、（３）炎症モデルの刺激による腸管細胞障害の評価とした。細胞株は、ヒト結腸癌由来株化細胞Caco-2は、RIKEN（継代数46）を使用し、0.4μmインサート上で14－21日間の長期培養を行った。播種するCaco-2細胞の濃度は、0.5×10*5/well、0.75×10*5/well、1.0×10*5/wellとした。インサートはHCL溶液で希釈したセルマトリックスタイプⅠ－Cにてコラーゲンコーティングを行った。腸管上皮モデルの評価方法は、形態学的評価、経上皮電気抵抗値の測定、LDH放出率の算出とした。複合培養による炎症モデルの刺激による腸管細胞障害の評価を行うため、新規発症のクローン病患者および基礎疾患のない対照群の血清、抽出した末梢血単核球細胞を保存した。今後、インサート内に播種した腸内細菌と免疫反応を起こした末梢血単核球細胞よりtotal RNAを精製し、マイクロアレイで発現解析を行う。また、培養液中に分泌されたサイトカインの解析や免疫反応前後の末梢血単核球細胞のポピュレーションをフローサイトメトリーによりタイピングし、免疫応答のカスケードについて検討していく。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
腸管上皮細胞モデルの確立において、Caco-2細胞による安定した単層の細胞膜の作成に苦慮している。播種する細胞濃度、培地や培養条件、インサート上のコラーゲンコーティングの方法等について、検討を行っている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
腸管上皮細胞モデルが確立されれば、インサート内に播種した腸内細菌と免疫反応を起こした末梢血単核球細胞よりtotal RNAを精製し、マイクロアレイで発現解析を行う。また、培養液中に分泌されたサイトカインの解析や免疫反応前後の末梢血単核球細胞のポピュレーションをフローサイトメトリーによりタイピングし、免疫応答のカスケードについて検討していく。
|
