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癌で高率に異常なメチル化を受けているCHFRは、微小管阻害剤に反応し分裂期チェックポイント機能を担う重要なRING型ユビキチンリガーゼである。本研究ではCHFR結合分子の同定を試み、微小管ストレスに対する応答や細胞死のメカニズムを明らかにし微小管阻害剤感受性診断法へ応用することを目的とした。酵母two-hybrid法によるCHFR結合分子のスクリーニングで、ユビキチン前駆体、複数のE2酵素および他の分子が同定された。単離された分子のうち、clone #319はCHFRのFHAドメインに結合を示すことがtwo-hybrid法による解析で確認された。#319のmRNA発現レベルはdocetaxel投与後24時間まで一定であり、微小管ストレス下でCHFRの補助因子として機能する可能性が示唆された。一方単離されたE2酵素のうち、Ubc13はCHFRを介したユビキチン化に関与し、CHFRによる非分解系のポリユビキチン化の重要性を示した。GFP-CHFRを安定発現するHela細胞を樹立しその細胞内局在を解析した所、GFP-CHFRは間期は核内に存在し、分裂期の核膜崩壊後は細胞全体に拡散、細胞質分裂後は再び核内に集積することを明らかにした。またGFP-CHFRの細胞内局在は微小管阻害剤処理後も処理前と同様のパターンを示した。GFP-CHFRを用いたCHFRの蛋白安定性の解析では、CHFR自身は微小管ストレス下や分裂期においても安定であることが示された。また、口腔癌細胞のCHFRのRNAiノックダウン実験により、微小管阻害剤によるmitotic indexと細胞死の増加が確認され、微小管阻害剤の感受性増強にCHFRの発現低下が重要であることを明らかにした。今後はCHFRの基質の探索を通して微小管阻害剤感受性を規定するメカニズムを解明したい。
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