極限酵素の環境適応機構の解明

• 研究課題/領域番号: 16041229
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 金谷 茂則 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (30273585)
• 研究分担者: 高野 和文 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40346185)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 6,000千円 (直接経費: 6,000千円); 2005年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円); 2004年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
• キーワード: 超好熱古細菌 / 低温菌 / リボヌクレアーゼH / サチライシン / ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ / アミロイドペプチド / 結晶構造 / FKBP22 / 酵素 / 蛋白質 / 極限微生物 / 安定性 / 結晶機構

研究概要

生体分子の一つである蛋白質のほとんどは水溶液中で働くので、その構造や機能は水との相互作用で決まる。従って、好熱菌や低温菌の酵素がどのような機構で高温環境や低温環境に適応したのかを明らかにすることができれば、水と蛋白質の相互作用に関しても新たな知見の得られることが期待される。本年度は以下の成果を得た。
1.超好熱菌リボヌクレアーゼHIIの安定性が、オスモライト存在下で大きく向上することを見いだした。このことから、超好熱菌の細胞内には様々な安定化因子の存在することが示唆された。また、活性中心変異体の安定性が大きく向上することを明らかにした。このことから、超好熱菌酵素でも活性中心は不安定化されていることが示唆された。さらに、好熱菌リボヌクレアーゼHIIIの結晶構造を決定した。
2.超好熱菌サチライシンは、他の中温菌由来サチライシン同様プロ体からプロペプチドが切断されて活性型の成熟体になる。しかし、これらのサチライシンとは異なり、超好熱菌サチライシンの成熟化にはプロペプチドではなくCa^<2+>が必須であることを明らかにした。また、成熟体の構造がCa^<2+>の結合により大きく変化することを明らかにした。
3.低温菌FKBP22は、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ(PPIase)活性部位を含むC末端ドメインと2量体の形成に必要なN末端ドメインから成る。これらのドメインと部分変性した蛋白質の相互作用を解析することにより、N末端ドメインはPPIaseの蛋白質基質との結合に必要であることを明らかにした。
4.アミロイドβペプチド(Aβ_<28-42>)を超好熱菌リボヌクレアーゼHIIのC末端領域に導入した変異体を作製し、その結晶構造を解析した。その結果、野生型酵素ではαヘリックス構造を形成しているC末端領域が、変異体では逆平行βシートに近い構造を形成していることを明らかにした。

研究成果

• [雑誌論文] Structure of amyloid b fragments in aqueous environments. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kazufumi Takano
  • 雑誌名: FEBS J. 273 ページ: 150-158
• [雑誌論文] Crystal structure and structure-based mutational analyses of RNase HIII from Bacillus stearothermophilus : a new Type 2 RNase H with TBP-like substrate-binding domain at the N-terminus. (2006)
  • 著者名/発表者名: Hyongi Chon
  • 雑誌名: J.Mol.Biol. 356 ページ: 165-178
• [雑誌論文] Crystal structure of TBP-interacting protein (Tκ-TIP26) and implications for its inhibition mechanism of the interaction between TBP and TATA-DNA. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takahiko Yamamoto
  • 雑誌名: Protein Sci. 15 ページ: 152-161
• [雑誌論文] Amyloidogenecity and pitrilysin sensitivity of a lysine-free derivative of amyloid b-peptide cleaved from a recombinant fusion protein. (2006)
  • 著者名/発表者名: Joel Cornista
  • 雑誌名: J.Biotechnol. (in press)
• [雑誌論文] Gene cloning and in vivo characterization of a dibenzothiophene dioxygenase from Xanthobacter polyaromaticivorans. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Hirano
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. (in press)
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of thermostable RNase HIII from Bacillus stearothermophilus. (2005)
  • 著者名/発表者名: Hyongi Chon
  • 雑誌名: Acta Cryst. F61 ページ: 293-295
• [雑誌論文] Overproduction and preliminary crystallographic study of a human kynurenine aminotransferase II homologue from Pyrococcus horikoshii OT3. (2005)
  • 著者名/発表者名: Hyongi Chon
  • 雑誌名: Acta Cryst. F61 ページ: 319-322
• [雑誌論文] Gene cloning, overproduction, and characterizations of thermolabile alkaline phosphatase from a psychrotrophic bacterium. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Suzuki
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 69 ページ: 364-373
• [雑誌論文] Protein crystal growth using laser-processed seed crystals. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kengo Takeuchi
  • 雑誌名: Jpn.J.Appl.Phys. 44 ページ: 3177-3179
• [雑誌論文] Comparison of dibenzothiophen-degrading bacteria under low oxygen condition. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fumiya Kitauchi
  • 雑誌名: J.Environ.Biotechnol. 4 ページ: 117-120
• [雑誌論文] Crystal structure of a human kynurenine aminotransferase II homologue from Pyrococcus horikoshii OT3 at 2.20 Å resolution. (2005)
  • 著者名/発表者名: Hyongi Chon
  • 雑誌名: Proteins 61 ページ: 685-688
• [雑誌論文] Importance of a repetitive nine-residue sequence motif for intracellular stability and functional structure of a family I.3 lipase. (2005)
  • 著者名/発表者名: Clement Angkawidjaja
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579 ページ: 4707-4712
• [雑誌論文] Binding analysis of a psychrotrophic FKBP22 to a folding intermediate of protein using surface plasmon resonance. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Suzuki
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579 ページ: 5781-5784
• [雑誌論文] Phylogenetic analysis of condensation domain in the nonribosomal peptide synthetases. (2005)
  • 著者名/発表者名: Niran Roongsawang
  • 雑誌名: FEMS Microbiol.Lett. 252 ページ: 143-151
• [雑誌論文] Isolation and characterization of Rhodococcus sp. strains TMP2 and T12 that degrade 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristane) at moderately low temperatures. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kunihiro, N., Haruki, M., Takano, K., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: J.Biotechnol 115 ページ: 129-136
• [雑誌論文] Stabilities and activities of the N- and C-domains of FKBP22 from a psychrotrophic bacterium overproduced in E.coli. (2005)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, Y., Takano, K., Kanaya, S.
  • 雑誌名: FEBS Journal 272 ページ: 632-642
• [雑誌論文] Identification of single Mn^<2+> binding sites in the mutant proteins of E.coli RNase HI at Glu^<48> and/or Asp^<134> by X-ray crystallography. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsunaka, Y., Takano, K., Matsumura, H., Yamagata, Y., Kanaya, S.
  • 雑誌名: J.Mol.Biol. 345 ページ: 1171-1183
• [雑誌論文] Isolation and characterization of Xanthobacter polyaromaticivorans sp.nov. 127W that degrades polycyclic and heterocyclic aromatic compounds under extremely low oxygen conditions. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hirano, S., Kitauchi, F., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 68 ページ: 557-564
• [雑誌論文] Possible involvement of a FKBP family protein from a psychrotrophic bacterium Shewanella sp. SIB1 in cold-adaptation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, Y., Haruki, M., Takano, K., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 271 ページ: 1372-1381
• [雑誌論文] Mutational and structural-based analyses of osmolyte effect on protein stability. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takano, K., Saito, M., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: J.Biochem.(Tokyo) 135 ページ: 701-708
  • NAID: 10016200353
• [雑誌論文] Kinetic robust monomeric protein from a hyperthermophile. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mukaiyama, A., Takano, K., Haruki, M., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: Biochemistry 43 ページ: 13859-13866
• [雑誌論文] Cleavage of various peptides with pitrilysin from Escherichia coli: kinetic analyses using β-endorphin and its derivatives. (2004)
  • 著者名/発表者名: Comista, J., Ikeuchi, S., Haruki, M., Kohara, A., Takano, K., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 68 ページ: 2128-2137
  • NAID: 130000030954
• [雑誌論文] Gene cloning and biochemical characterizations of a thermostable ribonuclease HIII from Bacillus stearothermophilus. (2004)
  • 著者名/発表者名: Chon, H., Nakano, R., Ohtani, N., Haruki, M., Takano, K., Morikawa, M., Kanaya, S.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 68 ページ: 2138-2147
  • NAID: 130000030955