膜結合性コハク酸ユビキノン酸化還元酵素複合体のX線結晶解析

• 研究課題/領域番号: 16048203
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 京都工芸繊維大学
• 研究代表者: 原田 繁春 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (80156504)
• 研究分担者: 亀井 加恵子 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助教授 (00214544)
• 研究期間 (年度): 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 2004年度: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
• キーワード: 複合体II / 膜蛋白質 / 結晶化 / 電子伝達系

研究概要

大腸菌ComplexIIはファーメンター培養した大腸菌の内膜から、回虫ComplexIIは回虫筋肉ミトコンドリアから界面活性剤で可溶化しイオン交換クロマトグラフィーで精製した。結晶化は精製したComplexIIの膜貫通部を覆っている界面活性剤を結晶化に適した界面活性剤に置換し、ポリエチレングリコールを沈澱剤に使って透析法で行った。X線回折実験はSPring8で行った。大腸菌と回虫のComplexII結晶はともに3Å程度の分解能を示すが、液体窒素による凍結下でもX線照射による放射線損傷が認められ、データ測定の過程で分解能が著しく低下していった。そこで損傷を受けた結晶を新しい結晶に交換しながら、大腸菌ComplexIIについては約3000枚、回虫ComplexIIについては約4000枚の回折パターンをイメージングプレートを使って記録した。これらのイメージの中から放射線損傷の少ないものを選びだし、データ処理プログラムHKL2000で回折強度データに変換し、回虫のComplexIIについては3Åの分解能回折強度データを得た。このデータをもとに微生物由来のComplexIIの立体構造をモデルとして分子置換法を適用したところ解が得られたので、立体構造の精密化に着手した。しかし、モデル構造と回虫ComplexIIとはアミノ酸配列の相同性(30%程度)の低さから予想されるように、大きく構造の異なる部分があり、そこでは電子密度図へのフィッティングが困難である。そこで、重原子同形置換法で求めた電子密度図を利用して構造解析・精密化を進めるために重原子誘導体結晶を調整し、回折強度データを測定した。現在、これらのデータをもとに構造解析を進めている。一方、ウシ心筋ミトコンドリア由来のComplexIIについても精製・結晶化を試みたところ、十分に精製されたサンプルではなかったが結晶が得られた。しかし、回折をほとんど示さなかっためで精製法や結晶化条件の最適化を行っている。