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機能性脂質ドメイン(ラフト)におけるコレステロールとタンパク質の相互作用の解析

研究課題

研究課題/領域番号 16048209
研究種目

特定領域研究

配分区分補助金
審査区分 生物系
研究機関横浜国立大学

研究代表者

片平 正人  横浜国立大学, 大学院・環境情報研究院, 助教授 (70211844)

研究分担者 岩下 淑子  財団法人東京都高齢者研究, 福祉振興財団・東京都老人総合研究所, 副参事研究員 (50111498)
研究期間 (年度) 2004
研究課題ステータス 完了 (2004年度)
配分額 *注記
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2004年度: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
キーワードラフト / コレステロール / 毒素 / Perfringolysin 0 / 生体膜 / 立体構造 / NMR / タンパク質
研究概要

我々はプロテアーゼによる限定分解と化学修飾を施して無毒化したPFOタンパク質が、ラフトを検出するプローブとして利用できる事を見出した。さらにPFOタンパク質中の約110アミノ酸からなる部位(D4)が、ラフト中のコレステロールへの選択的な結合能を有する事が分かった。
これまでD4は、大腸菌で大量発現させ、菌体破砕後の可溶性画分から調製していた。今回不溶性画分から大量に調製する方法を確立した。TritonX-100で洗浄し、グアニジンで可溶化し、ここにアルギニンを加えた。これを透析してグアニジン濃度を下げる事でリフォールディングを行った。得られたD4は従来の方法で調製したものと同様のCDスペクトルを与えた。^<13>C,^<15>N2重標識したD4を同様の手法で調製し、現在3重共鳴NMR法による共鳴線の帰属を進行させているところである。
次に膜環境を模した状態における構造解析を行う為に、D4をミセルに取り込ませる事を試みた。各種のdetergentを試みた結果、DPCが最も良好な結果を与えた。この状態におけるCDスペクトルは、水中におけるものとは少し異なっていた。
さらにより膜の環境に近づける為に、コレステロール含有のリポソームを調製し、そこにD4を取り込ませた。この状態のCDスペクトルも、水中におけるものとは少し異なっていた。今後はこの系に転移交差飽和法を適用する事によって、D4とコレステロール及びD4と脂質の相互作用様式を同定できると考えられる。
タンパク質とリガンドの複合体の構造決定及び水素結合の同定手法の開発等も行なったが、これらの技術は、今後膜結合に伴うPFOタンパク質の構造変化及びコレステロール・脂質との結合様式の原子レベルの分解能での解明に利用できる。

報告書

(1件)
  • 2004 実績報告書
  • 研究成果

    (6件)

すべて 2005 2004

すべて 雑誌論文 (6件)

  • [雑誌論文] Structure of hnRNP D : single-stranded telomere DNA complex and unfolding of quadruplex by hnRNP D2005

    • 著者名/発表者名
      Enokizono 他
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. (印刷中)

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Distinct localization of lipid rafts and externalized phosphatidyl serine at the surface of apoptotic cells2005

    • 著者名/発表者名
      Ishii 他
    • 雑誌名

      Biochem.Biophys.Res.Com. 327

      ページ: 94-99

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Perfringolysin O, a cholesterol-binding cytolysin, as a probe for lipid rafts2004

    • 著者名/発表者名
      Y.Ohno-Iwashita 他
    • 雑誌名

      Anaerobe 10

      ページ: 125-134

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Reduced sensitivity of Niemann-Pick C1-deficient cells to theta-toxin (perfrinigolysin O)2004

    • 著者名/発表者名
      Y.Ohsaki, 他
    • 雑誌名

      Histochem.Cell Biol 121

      ページ: 263-272

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Method for direct discrimination of intra- and intermolecular hydrogen bonds2004

    • 著者名/発表者名
      Sotoya 他
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Res. 32

      ページ: 5113-5118

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Axon dominant localization of cell-surface cholesterol in cultured hippocampal neurons and its disappearance in Niemann Pick type C model cells2004

    • 著者名/発表者名
      Tashiro 他
    • 雑誌名

      Eur.J.Neuroscience 20

      ページ: 2015-2021

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書

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公開日: 2004-04-01   更新日: 2018-03-28  

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