研究課題
基盤研究(A)
(1)スプライス・バリアント情報の収集:選択的スプライシングが疾患に関連すると考えられる遺伝子の抽出を行った。ASDBから選択的スプライシングによって複数のタンパク質が発現している遺伝子を、OMIMから癌・アルツハイマーなどの疾患に関連する遺伝子をそれぞれ抽出し、これら両方に含まれる候補遺伝子の絞込みを行った。(2)IVV法のハイスループット・スクリーニングシステムの構築:96個のベイトタンパク質に対するIVVスクリーニングを並列に行える自動化ロボットの最適化を行うとともに、大量に算出されるデータの解析処理速度を向上させた。(3)スプライシング関連遺伝子の大規模タンパク質間相互作用解析:96ウェルプレートでの並列セレクションを実施し、68種類のタンパク質をベイトとしたスクリーニングの結果、約1000相互作用を検出することに成功した。相互作用データの信頼性を評価するために、プルダウンアッセイによる検証を行った結果、約7割の信頼性確度をもつことがわかった。(4)タンパク質C末端蛍光ラベル化法による相互作用データの検証:上記の大規模実験データに対するスプライス・バリアント解析の結果、タンパク質相互作用部位がスプライス・バリアントによって変化している遺伝子が24個抽出された。この中の複数の遺伝子について、in vitroで検証実験を行ったところ、実際にスプライシングパターンの変化が相互作用に影響を及ぼしていることが確認された。(5)相互作用データベース構築と疾患の分子機序の解析:IVV法によって決定された相互作用領域情報に加えて、タンパク質複合体の結晶構造、選択的スプライシングおよびSNPに由来する可変領域、遺伝子が発現する組織に関する情報などを統合した新しいデータベースを開発した。これにより、選択的スプライシングによる翻訳産物の変化が遺伝子ネットワークの変化にどのように関わっているか解析することが可能となった。
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