| 研究課題/領域番号 |
16310152
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物分子科学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075)
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| 研究分担者 |
水谷 正治 京都大学, 化学研究所, 助手 (60303898)
清水 文一 京都大学, 化学研究所, 助手 (50324695)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
15,800千円 (直接経費: 15,800千円)
2006年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2005年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
2004年度: 8,300千円 (直接経費: 8,300千円)
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| キーワード | β-グリコシルアミジン誘導体 / β-グリコシダーゼ阻害剤 / 基質アナログ / グリコン基質特異性 / 植物グリコシダーゼ / アフィニティー精製 / 二糖配糖体特異的グリコシダーゼ / X線結晶構造解析 / 基質アナログリガンド / 二糖配糖体認識機構 / 静電的相互作用 / アフィニティーリガンド / family 20 β-N-acetylglucosaminidase / 中間体アナログ |
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| 研究概要 |
β-グリコシダーゼの特異的阻害剤として開発したβ-グリコシルアミジン誘導体をツールとして、グリコシダーゼの機能と生理学的意義を明らかにする生物有機化学的研究を行った。すなわち、酵素のグリコン基質特異性に応じた高い選択性で当該β-グリコシダーゼと結合する阻害剤の特長を活かし、β-グリコシルアミジン誘導体をリガンドとするアフィニティー吸着体を作製し、グリコン基質特異性を唯一の手がかりに未知のβ-グリコシダーゼを任意にアフィニティー精製する方法を確立した。これにより、二糖配糖体に高い基質特異性を示す新規グリコシダーゼを微生物より単離し、また、昆虫細胞に特徴的なN-グリカン糖鎖の生合成に関わる鍵酵素、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼを効率よくアフィニティー精製することにも成功した。そこで、植物の生体防御に重要な役割を果たしていると考えられる二糖配糖体特異的グリコシダーゼのβ-プリメベロシダーゼの酵素学的性質と植物における生理学的意義を明らかにするため、β-プリメベロシルアミジン誘導体を合成し、チャ葉よりβ-プリメベロシダーゼをアフィニティー精製し、その酵素学的性質を明らかにした。さらに、チャ葉から当該遺伝子をクローニングし、本酵素に代表される二糖配糖体特異的グリコシダーゼ類はfamily 1に属する立体保持型のβ-グリコシダーゼであり、単糖配糖体加水分解酵素から進化した一群の酵素であることを明らかにした。また、新たに考案したpH可変アフィニティークロマト法で高純度に精製した組み替えβ-プリメベロシダーゼを結晶化し、そのx線結晶構造解析を行ったところ、1.8Åの分解能で酵素の立体構造を解明することに成功した。リガンドであるβ-プリメベロシルアミジンの結合様式をもとに、非還元末端のβ-xylosyl部分を認識するアミノ酸残基が特定され、本酵素が二糖であるβ-プリメベロシドに対して高い基質特異性を示す構造基盤の全貌が明らかになった。
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