研究課題
基盤研究(B)
本研究では、ハイスループットな蛋白質間相互作用解析手法を確立し、それを用いてイネの多数の蛋白質の機能ネットワークを解明することを目的とした。まず二次元電気泳動で分離した蛋白質を、ダイヤモンド様炭素を被膜処理して得られるステンレス基板(DLC基板)にエレクトロブロッティングによって転写・固定化してプロテインチップを作製する方法を開発した。また、固定化した蛋白質を質量分析装置によって同定する方法、ならびに固定化した蛋白質と相互作用する蛋白質やペプチドをプロテインチップ上で検出し、質量分析装置で同定する方法も開発した。そして、これらの方法を実用的なレベルにまで改良することができた。一方、二次元電気泳動で分離され、DLC基板上に転写された蛋白質のうち、糖鎖を含有するものをDLC基板上で検出し、質量分析装置によって同定する方法も確立した。これらの方法を応用してイネカルス蛋白質およびダイズ種子蛋白質を二次元電気泳動で分離し、DLC基板に転写した。これに、アスパラギン結合型高マンノース型糖鎖と特異的に反応するコンカナバリンA(Con A)を結合させた。Con Aは蛍光試薬Cy5で標識した。その結果、ダイズ種子蛋白質に関しては、Con Aと反応した蛋白質を蛍光によって検出することができた。また、Con Aと反応した蛋白質を基板上でトリプシン消化後、質量分析装置によって同定することができた。この方法は、糖蛋白質をきわめて簡便・迅速に検出・同定できる方法であると考えられた。イネカルスについては、Con Aと反応する蛋白質を検出することはできたが、Con Aと反応した蛋白質を質量分析装置で同定することはできなかった。これはイネカルス抽出液中の蛋白質の量が十分でなかったためと推定される。今後、ごく微量の蛋白質でも検出できるようさらに高感度な手法を開発する必要があると考えられた。
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