ニワトリ始原生殖細胞への外来遺伝子導入法に関する研究

• 研究課題/領域番号: 16380193
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用動物科学
• 研究機関: 独立行政法人農業生物資源研究所
• 研究代表者: 内藤 充 独立行政法人農業生物資源研究所, 遺伝子組換え家畜研究センター, 上級研究員 (70355733)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 14,900千円 (直接経費: 14,900千円); 2006年度: 4,100千円 (直接経費: 4,100千円); 2005年度: 5,200千円 (直接経費: 5,200千円); 2004年度: 5,600千円 (直接経費: 5,600千円)
• キーワード: 始原生殖細胞 / 外来遺伝子 / トランスフェクション / GFP遺伝子 / ニワトリ初期胚 / 生殖系列キメラ / 品種識別 / 体外培養

研究概要

本研究では、形質転換ニワトリ作出技術の開発を目的として、始原生殖細胞の染色体に外来遺伝子を効率的に組み込む方法の開発を試みた。先ず、初期胚血液より始原生殖細胞を分離・濃縮する方法としてNycodentz密度勾配遠心分離法を開発、改良した。次いで、初期胚血液より採取した始原生殖細胞をリポフェクション法およびNucleofection法を用いて、GFP遺伝子の導入を試みた。さらに、血流中を循環中の始原生殖細胞を、リポフェクション法によりインピポのトランスフェクションを行い、GFP遺伝子の導入を試みた。その結果、リポフェクション法を用いた場合、インビトロおよびインビポのトランスフェクションにより、効率的にGFP遺伝子を始原生殖細胞に導入し発現させることが可能であった。Nucleofection法についても同様に始原生殖細胞へのGFP遺伝子の導入は可能であったが、効率はやや低い傾向が認められた。一方で、レシピエント胚へ移植した始原生殖細胞の消長を調べるため、初期胚血液から採取した始原生殖細胞を放卵直後の胚盤葉へ移植し、その後の消長をミトコンドリァDNAの1塩基多型を用いて調べたところ、移植された始原生殖細胞は生殖巣へ移住したことが確認された。この方法は、キメラニワトリから精子を採取し、移植した始原生殖細胞由来の精子が存在するか否かを判定することにも応用可能であった。始原生殖細胞への外来遺伝子導入をより効率的なものとするため、始原生殖細胞のインビトロでの培養を試みた。初期胚血液から採取した始原生殖細胞にGFP遺伝子を導入処理した後、フィーダー細胞上で培養した。その結果、一部でGFP遺伝子を発現しながら増殖する細胞集団が現れるようになった。今後は、インビトロで培養した始原生殖細胞が未分化性を維持しながら増殖できる培養条件を明らかにする必要があるものと考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Effect of soft X-ray irradiation on the migratory ability of primordial gem cells in chickens (2007)
  • 著者名/発表者名: Naito M, Harumi T, Minematsu T, Tajima A, Kuwana T
  • 雑誌名: British Poultry Science 48・2 ページ: 121-126
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Effect of soft X-ray irradiation on the migratory ability of primordial gem cells in chickens (2007)
  • 著者名/発表者名: Naito M, Harumi T, Minematsu, Tajima A, Kuwana T
  • 雑誌名: British Poultry Science 48-2 ページ: 121-126
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Conservation of a threatened indigenous fowl (Kureko Dori) using the germline chimeras transplanted from primordial germ cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kuwana, T., Kawashima, T., Naito, M., Yamashita, H., Matsuzaki, M., Takano, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 43・1 ページ: 60-66
  • NAID: 10017158581
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Effects of soft X-ray irradiation to stage X blastoderm on restriction of proliferation of primordial germ cells in early chicken embryos (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakamichi H, Sano A, Harumi T, Matsubara Y, Tajima A, Kosugiyama M, Naito M
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 43・4 ページ: 394-400
  • NAID: 10018324843
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Differentiation of female primordial germ cells in the male testes of chicken (Gallus gallus domesticus) (2006)
  • 著者名/発表者名: Tagami T, Kagami H, Matsubara Y, Harumi T, Naito M, Takeda K, Hanada H, Nirasawa K
  • 雑誌名: Molecular Reproduction and Development 74・1 ページ: 68-75
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Evidence of in vivo transfection of circulating primordial germ cells in chickens (2006)
  • 著者名/発表者名: Naito M, Harumi T, Matsubara Y, Kuwana T
  • 雑誌名: Proceedings of the 12th European Poultry Conference (CD) ページ: 1-6
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Conservation of a threatened indigenous fowl (Kureko Dori) using the germline chimeras transplanted from primordial germ cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kuwana, T., Kawashima, T., Naito, M., Yamashita, H., Matsuzaki, M., Takano, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 43-1 ページ: 60-66
  • NAID: 10017158581
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Effects of soft X-ray irradiation to stage X blastoderm on restriction of proliferation of primordial germ cells in early chicken embryos (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakamichi H, Sano A, Harumi T, Matsubara Y, Tajima A, Kosugiyama M, Naito M
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 43-4 ページ: 394-400
  • NAID: 10018324843
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Differentiation of female primordial germ cells in the male testes of chicken (Gallus gallus domesticus) (2006)
  • 著者名/発表者名: Tragami T, Kagami H, Matsubara Y, Harumi T, Naito M, Takeda K, Hanada H, Nirasawa K
  • 雑誌名: Molecular Reproduction and Development 74-1 ページ: 68-75
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Effects of soft X-ray irradiation to stage X blastoderm on restriction of proliferation of priomordial germ cells in early chicken embryos (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakamichi H, Sano A, Harumi T, Matsubara Y, Tajima A, Kosugiyama M, Naito M
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 43・4 ページ: 394-400
• [雑誌論文] Differentiation of female primordial germ cells in the male tastes of chicken (Gallus gallus domesticus) (2006)
  • 著者名/発表者名: Tagami T, Kagami H, Matsubara Y, Harumi T, Naito M, Takeda K, Hanada H, Nirasawa K
  • 雑誌名: Molecular Reproduction and Development 74・1 ページ: 72-80
• [雑誌論文] Evidence of in vivo transfection of circulating primordial germ cells in chickens (2006)
  • 著者名/発表者名: Naito M, Harumi T, Matsubara Y, Kuwana T
  • 雑誌名: Proceedings of the 12th European Poultry Conference CD ページ: 1-6
• [雑誌論文] Conservation of a threatened indigenous fowl(Kureko Dori) using the germline chimeras transplanted from primordial germ cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kuwana, T., Kawashima, T., Naito, M., Yamashita, H., Matsuzaki, M., Takano, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 43・1 ページ: 60-66
  • NAID: 10017158581
• [雑誌論文] Culture of chicken embryos obtained from the anterior region of the magnum of the oviduct after removing a thin layer of dense albumen capsule from the ovum (2005)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Sano, A., Kawashima, T., Nakamichi, H., Harumi, T., Matsubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・2 ページ: 140-144
  • NAID: 10015494744
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] New screening test for male germline chimeric chickens by polymerase chain reaction using single nucleotide polymorphism detection primers. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sano, A., Harumi, T., Hanzawa, S., Kawashima, T., Nakamichi, H., Matsubara, Y., Naito, M.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・2 ページ: 152-157
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] An attempt at fusing primordial germ cell with blood cell in chickens using inactivated Sendai virus or electrical stimulation. (2005)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Harumi, T., Matsubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・4 ページ: 369-374
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Culture of chicken embryos obtained from the anterior region of the magnum of the oviduct after removing a thin layer of dense albumen capsule from the ovum (2005)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Sano, A., Kawashima, T., Nakamichi, H., Harumi, T., Matsubara Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42-2 ページ: 140-144
  • NAID: 10015494744
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] New screening test for male germline chimeric chickens by polymerase chain reaction using single nucleotide polymorphism detection primers. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sano, A., Harumi, T., Hanzawa, S., Kawashima, T., Nakamichi, H., Matsubara, Y., Naito, M.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42-2 ページ: 152-157
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] An attempt at fusing primordial germ cell with blood cell in chickens using inactivated Sendai virus or electrical stimulation. (2005)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Harumi, T., Matsubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42-4 ページ: 369-374
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Culture of chicken embryos obtained from the anterior region of the magnum of the oviduct after removing a thin layer of dense albumen capsule from the ovum. (2005)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Sano, A., Kawashima, T., Nakamichi, H., Harumi, T., Matsubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・1 ページ: 140-144
  • NAID: 10015494744
• [雑誌論文] New screening test for male germline chimeric chickens by polymerase chain reaction using single nucleotide polymorphism detection primers. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sano, A., Harumi, T., Hanzawa, S., Kawashima, T., Nakamichi, H., Matsubara, Y., Naito, M.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・1 ページ: 152-157
• [雑誌論文] Culture of chicken embryos obtained from the anterior region of the magnum of the oviduct after removing a thin layer of dense albumen capsule from he ovum (2005)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Sano, A., Kawashima, T., Nakamichi, H., Harumi, T., Matsubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・2(印刷中)
• [雑誌論文] New screening test for male germline chimeric chickens by polymerase chain reaction using single nucleotide polymorphism detection primers (2005)
  • 著者名/発表者名: Sano, A., Harumi, T., Hanzawa, S., Kawashima, T., Nakamichi, H., Matsubara, Y., Naito, M.
  • 雑誌名: Journal of Poultry Science 42・2(印刷中)
• [雑誌論文] Production of chimeric chickens (2004)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Kuwana, T.
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 254・2 ページ: 245-253
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Migration of primordial germ cells isolated from embryonic blood into the gonads after transfer to stage X blastoderms and detection of germline chimaerism by PCR (2004)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Sano, A., Harumi, T., Matsubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: British Poultry Science 45・6 ページ: 762-768
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Polymerase chain reaction detection of single nucleotide polymorphisms in the chicken mitochondrial D-loop region. (2004)
  • 著者名/発表者名: Harumi, T., Sano, A., Kagami, H., Tagami, T., Matsubara, Y., Naito, M.
  • 雑誌名: Animal Science Journal 75・6 ページ: 503-507
  • NAID: 10018625050
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Migration of primordial germ cells isolated from embryonic blood into the gonads after transfer to stage X blastoderms and detection of germline chimaerism by PCR (2004)
  • 著者名/発表者名: Naito, M., Sano, A., Harumi, T., Matubara, Y., Kuwana, T.
  • 雑誌名: British Poultry Science 45-6 ページ: 762-768
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Polymerase chain reaction detection of single nucleotide polymorphisms in the chicken mitochondrial D-loop region. (2004)
  • 著者名/発表者名: Harumi, T., Sano, A., Kagami, H., Tagami, T., Matsubara, Y., Naito, M.
  • 雑誌名: Animal Science Journal 75-6 ページ: 503-507
  • NAID: 10018625050
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Quantitative genotyping by amplifying the polymorphic sequences of Pre-Melanosomal Protein (PMEL17) gene using real-time polymerase chain reaction in chickens
  • 著者名/発表者名: Minematsu T, Harumi T, Naito M
  • 雑誌名: (submitted)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Intense expression of GFP gene in gonads of chicken embryos by transfecting circulating primordial germ cells in vitro and in vivo
  • 著者名/発表者名: Naito M, Minematsu T, Harumi T, Kuwana T
  • 雑誌名: (submitted)
  • NAID: 10019768378
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Spermatogonia or primary oocytes from 20-day incubated embryos contribute to germline lineage after transfer into bloodstream of recipient embryos
  • 著者名/発表者名: Naito M, Minematsu T, Harumi T, Kuwana T
  • 雑誌名: (submitted)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] 新編畜産ハンドブック 2.4.4 ニワトリの育種 (2006)
  • 著者名/発表者名: 内藤 充
  • 出版者: 講談社
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] 新編畜産ハンドブック 2.14.4 家禽のバイオテクノロジー (2006)
  • 著者名/発表者名: 内藤 充
  • 出版者: 講談社
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Handbook of Animal Husbandry 2.4.4 Poultry breeding (2006)
  • 著者名/発表者名: Naito M
  • 出版者: Kodansha
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Handbook of animal Husbandry 2.14.4 Poultry biotechnology (2006)
  • 著者名/発表者名: Naito M
  • 出版者: Kodansha
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より