研究課題
基盤研究(B)
哺乳類中枢神経系発生過程においてNotchシグナルの活性化部位は従来未解明のままであったため、生体内でNotchシグナルの活性化を検出する技術(Notchレポーターシステム)を開発し、中枢神経系においてNotchシグナルの活性化と細胞運命決定の関わりを解析した。Notchの標的遺伝子であるHes1プロモーター下流に発光団形成時間および半減期が短く、かつ蛍光強度の強い蛍光蛋白質d4-Venusを発現するレポーター遺伝子を作成し活性化型Notchを発現した細胞株に導入したところ、このレポータ遺伝子はNotchシグナルの活性化に応答した蛍光を発することが確認された。作成したレポーター遺伝子をレンチウィルスに組み込み、胎児脳より調製した幼弱神経細胞に遺伝子導入後、Venusを発現する細胞をフローサイトメトリーにより分離しNeurosphere形成能を調べたところ、レポーター遺伝子発現糊包中にsphere形成細胞が有意に濃縮されていることが明らかになった。したがってNotchレポーターシステムにより、Notchシグナルの活性化が神経幹細胞の未分化維持能、多分化能に相関していることが明らかとなった。また、胎生後期より産生されるアストロサイトの分化過程において解析するとNotchシグナルは成熟したアストロサイトでは活性化していなかった。過剰発現系、loss of functionによりさらに解析するとNotchシグナルは神経幹細胞からアストロサイトへの初期誘導においては重要であるが,成熟にはむしろ阻害的であり,さらにNotchシグナルの活性化の度合いが低下することがアストロサイトの成熟に必要であることが示唆された。同様に組織幹細胞の自己複製広く関与することが知られているWntシグナルを検出するins-TOPEGFPおよびins-TOPGALレポーター遺伝子導入マウスを作製し、胎生および成体マウスにおける様々な組織におけるWntシグナル活性化のモニタリングを行った。胎児脳組織中では中脳および海馬でWntシグナルの強い活性化が見られたが、成体ではこれまで報告されていなかった中心周囲肝細胞における活性化および脾臓組織中に点在する活性化型Tリンパ球における活性が顕著であった。従って、我々の作製した遺伝子導入動物の観察により、成体ではこれまで報告のなかった肝臓および脾臓でのWnt canonical pathwayの活性化が明らかになり、今後、その生理的意義を明確にしていく必要性が示唆された。さらに、造血幹細胞の存在すると考えられる骨髄細胞を対象にTOP-GFPマウスの解析を行ったところ、GFPシグナルが全く検出できず、すでに報告されているWntシグナルと造血幹細胞の未分化性維持との関連性は確認できなかった。
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