| 研究課題/領域番号 |
16390083
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
鳥越 秀峰 東京理科大学, 理学部, 助教授 (80227678)
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| 研究分担者 |
緒方 一博 横浜市立大学, 医学部, 教授 (90260330)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
12,800千円 (直接経費: 12,800千円)
2006年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2005年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
2004年度: 6,900千円 (直接経費: 6,900千円)
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| キーワード | テロメア結合蛋白質 / テロメア1本鎖DNA / テロメラーゼ / 蛋白質-DNA相互作用 / 蛋白質-蛋白質相互作用 / 4本鎖DNA構造 / 未変性ゲル電気泳動 / CDスペクトル / 蛍光スペクトル / ゲルシフト法 / two-hybrid法 / Pull-down法 / 免疫沈降法 / 欠失変異株 / Pot1 |
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| 研究概要 |
Pot1のN末端側182アミノ酸残基がテロメア1本鎖DNA領域との特異的結合に必要なドメイン(DBD)であることを既に明らかにしており、大腸菌内での大量発現系を用いたPot1DBDの調製方法も既に確立していた。本研究では、この系を用いてPot1DBDを調製し、Pot1DBDの3次元構造を詳細に解析し、Pot1DBDが3本のαヘリックスと8本のβストランドを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)foldファミリーに属することを明らかにした。
次に、長さおよび塩基配列の異なる一連の変異型テロメア1本鎖DNAと野生型Pot1DBDの結合能をゲルシフト法で解析した。d(GGTTAC)がPot1DBDとの特異的結合に必要である、テロメア1本鎖DNA側の最適な塩基配列であることを明らかにした。また、一連の点変異型Pot1DBDとd(GGTTAC)との結合能をゲルシフト法で解析した。野生型と比較して、S58A, K90AおよびD125Aはd(GGTTAC)との結合能がほとんど変化しなかったが、D64A, Q120LおよびK124Aはd(GGTTAC)との結合能が有意に低下した。複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が示唆されているアミノ酸残基の中でも、複合体形成への関与の度合が大きいアミノ酸残基と小さいアミノ酸残基があることを明らかにした。
一方、未変性ゲル電気泳動とCDスペクトルより、分裂酵母テロメアDNA配列4G4:d(G_4TTAC)_4が150mM NaCl存在下でアンチパラレル型4本鎖DNA構造を形成することを明らかにした。次に、4G4のアンチパラレル型4本鎖DNA構造にPot1DBDを添加した際のCDスペクトル変化から、Pot1DBDがアンチパラレル型4本鎖DNA構造を減少させる活性を有することを明らかにした。また、5'末端と3'末端を各々蛍光色素と消光色素で標識した4G4のアンチパラレル型4本鎖DNA構造にPot1DBDを添加した際の蛍光スペクトル変化から、Pot1DBDがアンチパラレル型4本鎖DNA構造をほどく活性を有することも明らかにした。さらに、4G4のアンチパラレル型4本鎖DNA構造またはd(GGTTAC)の1本鎖DNA構造と一連の点変異型Pot1DBDとの相互作用を解析し、1本鎖DNA構造に結合する活性が強い点変異型Pot1DBDほど、アンチパラレル型4本鎖DNA構造をほどく活性が強いことを明らかにした。Pot1DBDが1本鎖DNA構造に結合すると遊離状態の1本鎖DNAの量が減少するため、アンチパラレル型4本鎖DNA構造と1本鎖DNA構造との間の平衡が1本鎖DNA構造のほうにシフトしてしまい、これがアンチパラレル型4本鎖DNA構造をほどくのを誘発すると考えられる。
一方、Pot1のC末端領域をbaitとしてcDNAライブラリーの発現産物をtwo-hybrid法でメクリーニングしたところ、Pot1のC末端領域と相互作用する可能性のある蛋白質としてsnoRNPの1つであるGAR1を分離した。Pull-down法と免疫沈降法によりPot1のC末端領域とGar1が直接的にin vitroで相互作用することを明らかにした。また、in vivoにおけるGar1のテロメア長への影響を解析するためにGar1欠失変異株を作製したところ、表現型は致死であった。Gar1欠失変異株では、Pot1がGar1を介してテロメラーゼをリクルートするということが起きず、テロメアが短くなりすぎて致死になったことが考えられる。これらより、Pot1はGar1を介してテロメラーゼと間接的に結合するという作業仮説を提示できる。
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