| 研究課題/領域番号 |
16390235
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
呼吸器内科学
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
黒木 由夫 札幌医科大学, 医学部, 教授 (70161784)
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| 研究分担者 |
高橋 弘毅 札幌医科大学, 医学部, 教授 (60231396)
佐野 仁美 札幌医科大学, 医学部, 助教授 (80295344)
西谷 千明 札幌医科大学, 医学部, 助手 (30381255)
千葉 弘文 札幌医科大学, 医学部, 助手 (40347175)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
14,200千円 (直接経費: 14,200千円)
2005年度: 6,800千円 (直接経費: 6,800千円)
2004年度: 7,400千円 (直接経費: 7,400千円)
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| キーワード | 肺サーファクタント蛋白質 / コレクチン / SP-A / SP-D / Toll様受容体 / 貪食受容体 / MD-2 / エンドトキシン / スカベンジャー受容体 / 非定型抗酸菌 / CD14 |
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| 研究概要 |
本研究は、肺サーファクタント蛋白質AおよびD(SP-A、SP-D)とToll様受容体(TLR)のリガンド認識の分子機構とマクロファージによる細菌貪食機構を明らかにし、呼吸器感染症克服への臨床応用のための分子基盤を確立することを目的として遂行された。以下に研究成果を要約する。
1.Mycobacterium aviumは肺コレクチンのリガンドであり、SP-DはM.avium由来のリポアラビノマンナンに結合することを証明した。さらに、SP-AとSP-Dは、マクロファージのマンノース受容体の細胞表面発現を増強させることによって、マクロファージによるM.avium貪食を促進することを明らかにした。
2.SP-Aが肺胞マクロファージによるStreptococcus pneumoniaeとStaphylococcus aureusの貪食を促進することを証明した。さらに、貪食促進の機構として、SP-Aがカゼインキナーゼ2依存性に肺胞マクロファージ上のスカベンジャー受容体Aの局在を増強させることが示された。
3.TLR4とMD-2およびリポ多糖(LPS)との相互作用を解析し、Glu^<24->Leu^<631>から成るTLR4細胞外ドメインにMD-2が直接結合し、TLR4とMD-2との複合体がLPSに結合しうることを証明した。組換え可溶型TLR4細胞外ドメイン蛋白質(sTLR4)を作成し、sTLR4との相互作用によってMD-2のリピドA結合親和性が増すことを示した。sTLR4-MD-2複合体は、TLR4発現細胞へのLPS結合を阻害し、LPS惹起サイトカイン分泌を抑制した。さらに、マウス気管内LPS投与による肺炎症モデルにおいて、sTLR4-MD-2の同時投与は肺炎症を緩和させることが示され、エンドトキシン惹起肺炎症に対する臨床応用の可能性が示された。TLR4のN末端側領域Glu^<24>-Pro^<34>がTLR4とMD-2の相互作用に必須であることが示された。また、CD14のアミノ酸残基57-64領域がTLR2との結合に重要であることが証明された。
4.SP-AとSP-DはsTLR4に結合し、その結合はCa^<2+>依存性であったが、糖鎖除去sTLR4にも結合したので、蛋白質間相互作用による結合と考えられた。単クローン抗体を用いたエピトープマッピングにより、SP-Dは糖鎖認識領域を介してsTLR4に結合することが示された。コラゲナーゼ処理SP-A(CRF)は、ネック領域と糖鎖認識領域からなる3量体を呈して、TLR4に対する親和性は18量体を呈する野生型SP-Aに比べて著しく低下していた。SP-Aは、TLR4/MD-2発現HEK293細胞でのsmooth LPS惹起NF-κB活性化を有意に低下させるが、CRFによるNF-κB活性化抑制効果は18量体SP-Aに比較して著明に減弱していた。このことは、SP-AのN末端側とコラーゲン様領域による高次多量体構造の形成がTLRを介する炎症反応の制御に重要であることを示している,
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