膜透過性ペプチド核酸を利用したリアルタイム細胞内微小環境pHセンサーの開発

• 研究課題/領域番号: 16500200
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 神経科学一般
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 富澤 一仁 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (40274287)
• 研究分担者: 松下 正之 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 講師 (30273965) ; 松井 秀樹 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (30157234)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円); 2005年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 2004年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
• キーワード: ペプチド核酸 / ポリアルギニン / 核酸 / 生体分子 / 生体イメージング / 細胞 / 蛋白質導入法 / TAT / センサー / リアルタイム / イメージング / 蛋白導入法 / FRET

研究概要

細胞膜不透過性であるペプチド核酸(PNA)に膜透過性ペプチドを付加することにより、膜透過型ペプチド核酸の開発に成功した。本研究では、このペプチド核酸を利用して以下の細胞内蛋白機能解析方法の開発を目的とした研究を実施した。1.遺伝子発現制御・・・哺乳細胞発現用プラスミドDNAとハイブリダイズする最適膜透過性PNAの決定と合成を行った。同PNAとプラスミドを反応させ、その後細胞培養液中に添加することで、培養細胞に遺伝子を導入する技術開発に成功した。さらに、導入効率を良くするための技術開発を行った。2.蛋白発現制御・・・膜透過性PNA-p53アンチセンスを癌細胞に導入することにより、同細胞内の変異p53蛋白・mRNAの発現抑制に成功した。また、本技術と我々が開発していたp53蛋白導入法を組みあわせることにより、癌細胞に発現しているp53を変異型から正常型に置換する蛋白置換法の開発に成功した。3.In situ細胞内環境測定・・・シトシンの位置を変化させた10個のDNAを作製し,pH7付近を測定するのに最も適したアンチパラレルDNA配列を探索した。そして、AGAAAGAGAAGAの塩基配列が最もpHの低下に伴って,Cy3由来の564nm付近蛍光強度が減少し,最も効率よくFRET効果を示すことが判明した。さらに、この配列を有するPNAを作製し、細胞内に導入することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] p53 protein transduction therapy : successful targeting and inhibition of the growth of the bladder cancer cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inoue, M., Tomizawa, K.et al.
  • 雑誌名: Eur. Urol. 49 ・ 1 ページ: 161-168
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] p53 protein transduction therapy : Successful targeting and inhibition of the growth of the bladder cancer cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inoue, M., Tomizawa, K., Matsushita, M., Lu, Y.-F., Yokoyama, T., Yanai, H., Takashima, A., Kumon, H., Matsui, H.
  • 雑誌名: Eur.Urol. 49・1 ページ: 161-168
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The NH-2-terminal of influenza virus hemagglutinin-2 subunit peptides enhance the anti-tumor potency of poly-arginine-mediated p53 protein transduction. (2005)
  • 著者名/発表者名: Michiue, H., Tomizawa, K.et al.
  • 雑誌名: J. Bio1. Chem. 280 ・ 9 ページ: 8285-8289
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Ubiquitination-resistant p53 protein transduction therapy facilitates anti-cancer effect on the growth of human malignant glioma cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Michiue, H., Tomizawa, K.et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579 ・ 18 ページ: 3965-3969
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cdk5-dependent regulation of glucose-stimulated insulin secretion. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wei, F.-Y., Tomizawa, K.et al.
  • 雑誌名: Nature Med. 11 ・ 10 ページ: 1104-1108
  • NAID: 130005447816
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Control of cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) activity by glutamatergic regulation of p35 stability. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wei, F.-Y., Tomizawa, K.et al.
  • 雑誌名: J. Neurochem. 93 ・ 2 ページ: 502-512
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Truncation and activation of calcineurin A by calpain I in Alzheimer disease brain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Liu, F., Tomizawa, K.et a1.
  • 雑誌名: J. Bio1. Chem. 280 ・ 45 ページ: 37755-37762
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The NH-2-terminal of influenza virus hemagglutinin-2 subunit peptides enhance the anti-tumor potency of poly-arginine-mediated p53 protein transduction. (2005)
  • 著者名/発表者名: Michiue, H., Tomizawa, K., Wei, F.-Y., Matsushita, M., Lu, Y.-F., Ichikawa, T., Tamiya, T., Date, I., Matsui, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280・9 ページ: 8285-8289
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Ubiquitination-resistant p53 protein transduction therapy facilitates anti-cancer effect on the growth of human malignant glioma cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Michiue, H., Tomizawa, K., Matsushita, M., Tamiya, T., Lu, Y.-F., Ichikawa, T., Date, I., Matsui, H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579・18 ページ: 3965-3969
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Cdk5-dependent regulation of glucose-stimulated insulin secretion. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wei, F.-Y., Nagashima, K., Ohshima, T., Saheki, Y., Lu, Y.-F., Matsushita, M., Yamada, Y., Mikoshiba, K., Seino, Y., Matsui, H., Tomizawa, K.
  • 雑誌名: Nature Med. 11・10 ページ: 1104-1108
  • NAID: 130005447816
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Control of Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) activity by glutamatergic regulation of p35 stability. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wei, F.-Y., Tomizawa, K., Ohshima, T., Asada, A., Saito, T., Nguyen C., Bibb, JA., Ishiguro, K., Kulkami, A.B., Pant, H.C., Mikoshiba, K., Matsui, H., Hisanaga, S.
  • 雑誌名: J.Neurochem. 93・2 ページ: 502-512
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Truncation and activation of calcineurin A by calpain I in Alzheimer disease brain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Liu, F., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Oda, Y., Tomizawa, K., Gong C.-X.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280・45 ページ: 37755-37762
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The NH2-terminal of influenza virus hemagglutinin-2 subunit peptides enhance the anti-tumor potency of poly-arginine-mediated p53 protein transduction. (2005)
  • 著者名/発表者名: Michiue H, Tomizawa K, Wei FY, Matsushita M, Lu YF, Ichikawa T, Tamiya T, Date I, Matsui H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(9) ページ: 8285-8289
• [雑誌論文] Calpain inhibitors prevent neuronal cell death and ameliorate motor disturbances after compression-induced spinal cord injury in rats. (2005)
  • 著者名/発表者名: Arataki S, Tomizawa K, Moriwaki A, Nishida K, Matsushita M, Ozaki T, Kunisada T, Yoshida A, Inoue H, Matsui H.
  • 雑誌名: J.Neurotrauma 22(3) ページ: 398-406
• [雑誌論文] Regulation of synaptic vesicle recycling by calcineurin in different vesicle pools. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kumashiro S, Lu YF, tomizawa K, Matsushita M, Wei FY, Matsui H.
  • 雑誌名: Nerosci.Res. 51(4) ページ: 435-443
  • NAID: 130005447570
• [雑誌論文] Channel function is dissociated from the intrinsic kinase acitivty and autophosphorylation of TRPM7/ChaK1. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsushita M, Kozak JA, Shimizu Y, McLachlin DT, Yamaguchi H, Wei FY, Tomizawa K, Matsui H, Chait BT, Cahalan MD, Nairn AC.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(21) ページ: 20793-20803
• [雑誌論文] Regulation of N-methyl-D-asparate receptors by calpain in cortical neurons. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wu HY, Yuen EY, Lu YF, Matsushita M, Matsui H, Yan Z, Tomizawa K
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(22) ページ: 21588-21593
• [雑誌論文] Ubiquitination-resistant p53 protein transduction therapy facilitates anti-cancer effect on the growth of human malignant glioma cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Michiue H, Tomizawa K, Matsushita M, Tamiya T, Lu YF, Ichikawa T, Date I, Matsui H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579(18) ページ: 3965-3969
• [雑誌論文] A new approach to inhibiting astrocytic IP3-induced intracellular calcium increase in an astrocyte-neuron co-culture system. (2005)
  • 著者名/発表者名: Saheki Y, Li ST, Matsushita M, Wu YM, Cai WH, Wei FY, Lu YF, Moriwaki A, tomizawa K, Matsui H.
  • 雑誌名: Brain Res. 1055(1-2) ページ: 196-201
• [雑誌論文] Cdk5-dependent regulation of glucose-stimulated insulin secretion. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wei FY, Nagashima K, Ohshima T, Saheki Y, Lu YF, Matsushita M, Yamada Y, Mikoshiba K, Seino Y, Matsui H, Tomizawa K.
  • 雑誌名: Nat.Med. 11(10) ページ: 1104-1108
  • NAID: 130005447816
• [雑誌論文] p53 protein transduction therapy : successful targeting and inhibition of the growth of the bladder cancer cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Inoue M, Tomizawa K, Matsushita M, Lu YF, Yokoyama T, Yanai H, Takashima A, Kumon H, Matsui H.
  • 雑誌名: Eur.Urol. 49(1) ページ: 161-168
• [雑誌論文] Truncation and activation of calcineurin A by calpain I in Alzheimer disease brain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Liu F, Grundke-Iqbal I, Iqbal K, Oda Y, tomizawa K, Gong CX.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(45) ページ: 37755-37762
• [雑誌論文] カルシニューリン(PP2B)の恒常的活性化機構と神経細胞死制御-カルシニューリンとカルパインのクロストーク- (2004)
  • 著者名/発表者名: 松井秀樹, 呉 海燕, 富澤一仁
  • 雑誌名: 細胞工学 Vol.23・No.5 ページ: 533-537
• [雑誌論文] タンパク質セラピー法 (2004)
  • 著者名/発表者名: 松下正之, 富澤一仁, 松井秀樹
  • 雑誌名: 実験医学 Vol.22・No.18
• [雑誌論文] Critical role of calpain-mediated cleavage of calcineurin in excitotox neurodegeneration. (2004)
  • 著者名/発表者名: Wu, H.-Y., Tomizawa, K., Matsushita, M., Matsui, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 4929-4940
• [雑誌論文] HIV-1 tat inhibits long-term potentiation and attenuates spatial learning. (2004)
  • 著者名/発表者名: Li, S.-T., Matsushita, M., Tomizawa, K., Matsui, H.
  • 雑誌名: Ann.Neurol 55 ページ: 362-371
• [雑誌論文] A new cell-permeable peptide allows successful allogeneic islet transplantation in mice. (2004)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, H., Matsushita, M., Tomizawa, K., Matsui, H.
  • 雑誌名: Nature Med. 10 ページ: 305-309
• [雑誌論文] Photo-acceleration of protein release from endosome in the protein transduction system. (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsushita, M., Tomizawa, K., Matsui, H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 572(1-3) ページ: 221-226