| 研究課題/領域番号 |
16510167
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物分子科学
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
松井 太衛 藤田保健衛生大学, 衛生学部, 教授 (90183946)
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| 研究分担者 |
浜子 二治 (濱子 二治) 藤田保健衛生大学短期大学, 医療情報技術科, 助教授 (80180933)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2006年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2004年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | フォンビルブランド因子 / 血小板 / ヘビ毒 / ポトロセチン / レクチン / ADAMTS13 / ボトロセチン / 血小板凝集 / ニューロトキシン / フォンビルブランド病 / 血栓形成 / 遺伝子クローニング / C-タイプレクチン / ビチセチン / アミノ酸配列 |
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| 研究概要 |
1)ヘビ毒由来C型レクチンの構造と性質
C. ruberヘビ毒からC型レクチン(CRL)を精製し全アミノ酸配列を決定した。CRLは、C. atroxヘビ毒レクチン(CAL)と高いホモロジーを示した。CRLとCALでは、金属イオン要求性に差異が見られ、アミノ酸置換が金属イオン結合サイトの立体構造に影響するものと思われた。
2)ボトロセチン遺伝子のクローニングとリコンビナント発現
B. jararacaヘビ毒腺のcDNAライブラリーの中から、ボトロセチンの遺伝子クローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を解析したところ、α鎖では4残基のアミノ酸置換と、1残基の欠失が見られた。一方、βサブユニットに関しては、ボトロセチンβ鎖と87-88%の相同性を持ったクローンを得た。クローニングしたボトロセチンα、β両鎖のcDNAを発現ベクターに組み込み293T細胞にトランスフェクションした。培養液を回収し、濃縮後に非還元条件下でSDS電気泳動にかけ、抗ボトロセチン抗体でウエスタンブロッティングをおこなったところ、ポトロセチンと同じ移動度に陽性バンドを認めた。多血小板血漿を調製し、培養細胞から得られた培養液を一部加えたところ、フォンビルブランド因子(VWF)依存性の血小板凝集が起こった。培養細胞系でリコンビナント・ボトロセチンの産生に初めて成功した。
3)キングコブラ毒由来VWF結合性因子の単離
キングコブラ毒からVWF結合性で血小板凝集を阻害する分画を見出し、部分精製をおこなった。非還元条件でこの成分はVWFと結合したが還元すると活性は消失した。また、この活性成分はカルシウムイオン依存的に血小板凝集を阻害した。
4)ADAMTS13分子に存在する糖鎖の解析
ADAMTS13に存在する糖鎖をSSA, MAM, RCAI20, PNAなどのレクチンを用いて探索した結果、非還元末端はシアル酸であり、その内側はβ1-4またはβ1-3結合したガラクトースと考えられた。一方、VWFに見られるようなABO血液型糖鎖は存在しなかった。
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