タンパク質膜透過装紙SecA-SecYE複合体の構造解析

• 研究課題/領域番号: 16570094
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 森 博幸 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (10243271)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円); 2005年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: 膜タンパク質 / タンパク質膜透過 / SecA / SecYE / 高度好熱菌 / 結晶構造 / X線 / X線結晶構造解析 / SecY / SecE / ATPase / チャネル

研究概要

タンパク質が膜を越える反応は、全ての生物で見られる普遍的な生命現象であり、そのメカニズムの解明は、細胞生物学の最も基本的かつ重要な研究課題の1つといえる。タンパク質膜透過反応は、膜透過「チャネル」を介して起こる。進化的に保存された膜内在性タンパク質からなるSecYE/Sec61複合体が中心的な役割を果たしているが、その実体は不明である。本研究は、膜透過駆動モーターSecAとSecYEとの複合体の分子レベルの高次構造を明らかにし、タンパク質の膜透過の機構を分子レベルで明らかにすることを最終的な目的として、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のタンパク質を材料にX線結晶構造解析を進めた。昨年までにTSecA, TSecYEの発現・精製系は構築済みであり、TsecAについては、2.8Å分解能で立体構造を明らかにしている。TsecYEも6Å分解能のデータセットは得られていたものの、分子レベルの構造決定には、更なる結晶の質の改良が必要であった。そこで、今年は、TSecYEに対する特異的なモノクローナル抗体を作製し、そのFabフラグメントとTSecYE複合体共結晶の構造解析を試みた。TSecYEと安定に複合体を形成できるモノクローナル抗体株の樹立・Fab化にも成功した。調製したFabがTSecYEと安定な複合体を形成する事は、ゲルろ過等の実験から確認した。このTSecYE-Fab複合体を用いく結晶化を進め、既にとある条件で共結晶を得ている。現在、結晶化条件の最適化を進めている。上記のプロジェクトと平行して、膜透過装置と複合体を形成し、機能制御を行っているSecDFタンパク質の精製結晶化も進め、TSecDFの3次元結晶を得て、予備的X線データの取得も終了している。現在は、モデルの精密化を進めている、近々世界に先駆けて立体構造が報告できるものと期待している。

研究成果

• [雑誌論文] Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction of SecDF, a translocon-associated membrane protein, from Thermus thermophilus (2006)
  • 著者名/発表者名: Tsukazaki T, Mori H et al.(15名)
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F. 62 ページ: 376-380
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction of SecDF, a translocon-associated membrane protein, from Therm us thermophilus (2006)
  • 著者名/発表者名: Tsukazaki, T., Mori, H., Fukai, S., Numata, T., Perederina, A., Adachi.H., Matsumura, H., Takano, K., Murakami, S., Inoue, T., Mori, Y., Sasaki, T., Vassylyev, D.G., Nureki, O., Ito, K.
  • 雑誌名: Acta Ciystallographica Section F 62 ページ: 376-380
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Purifiction, crystallization and preliminary X-ray diffraction of ScDF a translocon associated membrane protein, from Thermurs thermophilus (2006)
  • 著者名/発表者名: Tsukazaki T, Mori H et al. (15名)
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F 62 ページ: 376-380
• [雑誌論文] SecM facilitates translocase function of SecA by localizin its biosynthesis (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakatogawa H, Murakami A, Mori H, Ito K
  • 雑誌名: Genes & Development 19 ページ: 436-444
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] SecM facilitates translocase function of SecA by localizing its biosynthesis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakatogawa, H., Murakami, A., Mori, H., Ito, K.
  • 雑誌名: Genes & Development 19 ページ: 436-444
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] SecM facilitates translocase function of SecA by localizing its biosynthesis (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakatogawa, H., Murakami, A., Hori, H., Ito, K.
  • 雑誌名: Genes and Development 19 ページ: 436-444
• [雑誌論文] Mutational analysis of transmembrane regions 3 and 4 of SecY a central component of protein translocase (2004)
  • 著者名/発表者名: Mori H, Shimokawa N, Satoh Y, Ito K
  • 雑誌名: J. Bacteriol. 186 ページ: 3960-3969
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Mutational analysis of transmembrane regions 3 and 4 of SecY, a central component of protein translocase (2004)
  • 著者名/発表者名: Mori, H., Shimokawa, N., Satoh, Y., Ito, K.
  • 雑誌名: J.Bacteriol. 186 ページ: 3960-3969
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Mutational Analysis of Transmembrane Regions 3 and 4 of SecY, a Central Component of Protein Translocase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mori, H., Shimokawa, N., Satoh, Y., Ito, K.
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 186 ページ: 3960-3969