| 研究課題/領域番号 |
16570107
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 助手 (60241428)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2005年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2004年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | 筋小胞体 / カルシウムポンプ / SERCA1a / リン酸化中間体 / 疎水的相互作用 / Ca^<2+>輸送 / エネルギー共役 / 酵素反応速度論 |
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| 研究概要 |
組み替えタンパク発現系の最適化
Adeno virus、lipofection法electroporation法を試みその結果を比較し、どの方法を用いても、ミクロソームタンパク当たり2%以上の発現量を得た。また定常的にSERCA1aを発現する組み替え細胞も作成したが、十分な発現量は得られなかった。以上の結果、lipofection法をもちいて一過的に強制発現させたSERCA1aを用い解析を行うことが最適であった。
COS-1細胞Microsome分画にしたSERCA1aを用いたCa^<2+>結合量測定法の確立
今研究で、washerの組成を検討することにより、従来困難であった、発現SERCA1aへのCa^<2+>結合を直接測定する方法を確立し、簡便、安全にSERCA1a変異体の酵素学的性質をより詳細に調べることが出来るようにした。
SERCA1a変異体のE2P中間体に存在する、内腔向き高親和性Ca^<2+>結合部位の発見
定常状態でADP-非感受性EP(E2P+E2PCa)の量を測定した結果、ADP-非感受性EPの量はWTではCa^<2+>濃度を変化させても変わらないが、Y122A変異体ではCa^<2+>濃度に依存してADP-非感受性EPの量が変化した。またCa^<2+>濃度依存性はpHによって大きく変化し、pHが高いほど、高いCa^<2+>依存性を示した。これから求めた見掛けのCa^<2+>親和性は、PH7.3で、150μM程度であり、E2Pは内腔側のCa^<2+>に対して高い親和性を持っていた。
E2PCa中間体の検出
SERCA1aをCa^<2+>存在下、ATPを添加してリン酸化し、定常状態でのE1P量とCa^<2+>結合量の比較を行った結果WTの場合E1Pの比率と、Ca^<2+>結合量が完全に一致したのに対し、変異体ではE1Pの比率よりCa^<2+>の結合量の方が多かった。この結果はSERCA1aの反応経路にCa^<2+>を結合したE2P中間体(E2PCa)が存在することを強く示唆している。
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