研究課題
基盤研究(C)
転写活性ドメインを持つ転写因子P53について、VP16との融合蛋白質を発現するコンストラクトを作成して哺乳動物細胞2ハイブリッド法(M2H)により、結合するGa14融合蛋白質をスクリーニングした。その結果、顕著なレポーター活性を示すものが2つ取れてきた。一つはmdm2であり、P53との相互作用は既に報告されている。もう一つは分子量17kDaの機能未知蛋白質であった。この蛋白質とP53をタグ付き蛋白質として細胞に発現させ、免疫沈降を試みたが相互作用証明はできなかった。我々は、迅速なin vitroプルダウンアッセイ法を開発したので、この方法を用いて実験を行ったが17kDa蛋白質とP53との相互作用は確認されなかった。そこで次にマウス転写因子を対象としてM2Hを用いてタンパク相互作用を系統的に調べた。対象cDNA数は約1,700個で、そのうち約14%がGa14融合タンパク質単独を用いたプレアッセイで転写活性化を示した。通常のタンパク質では2-3%であることを考慮すると非常に高い比率である。タンパク相互作用アッセイの結果、約4,000の相互作用を同定した。これは720の組み合わせに1個の相互作用が見つかったことになり、通常の頻度(数千に1個)と比較すると高い値を示した。2ハイブリッド法によって見出された相互作用には多くの擬陽性が含まれているので、上記のin vitro法を用いて相互作用の再現性を調べた。M2Hで陽性を示し、かつ既に個々の文献で既知となっている相互作用では90%以上が陽性と判定された。M2H陽性、かつ文献に報告が無い相互作用については、レポーター活性が6倍以上のとき陽性率は60数%の値を示した。得られたデータにはまだ擬陽性は含まれているものの、真の相互作用を濃縮することができた。
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