| 研究課題/領域番号 |
16580046
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
植物栄養学・土壌学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
江崎 文一 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助教授 (90243500)
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| 研究分担者 |
中島 進 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助教授 (60033122)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2006年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2005年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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| キーワード | aluminum (Al) stress / gene response mechanism / Al stress induced gene / transcription factor / glutathione S-transferase / oxidative stress / signal transduction / Arabidopsis thaliana / Ring Zinc finger protein / Homeobox-Leucine Zipper / 転写調節因子 / アルミニウム(Al)ストレス / ゲルシフトアッセイ / Bio-panning / AtGST11遺伝子 / 遺伝子発現応答機構 / aluminum(Al)stress / glutathione S-transferase (GST) |
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| 研究概要 |
1.AtGST11遺伝子の発現転写調飾因子の単離のためのcDNAライブラリーの構築とスクリーニング
Al誘導性のAtGST11遺伝子の転写調節因子の単離のため、Al処理した植物体由来のmRNA画分を用いてcDNANAを調製し、さちにベクターとなるphage DNAに連結させてcDNAライブラリーを構築した。
アフィニティーカラムをベースにしたbio-panning法でラノブラリーのスクリーニングを行い,転写因子遺伝子群の単離を試み、転写因子をコードすると思われる9個の候補クローンを得た。
2.単離された遺伝子の塩基配列の決定と既存の配列との相同性を検討
得られた8クローンの塩基配列を決定した。その結果、これらの中で明らかに転写調節因子をコードしでいると思われるものは、#13(C3KC4-type Ring Zinc.finger protein)と#43(HomeBox-Leucine Zipper protein 6)であった。なお#4は機能未知であるので、転写調節因子の可能性がある。
3.ゲルシフトアッセイによる特異的な目的DNA断片との相互作用の確認
上記の3クローンは完全長のものではなかったので、理研等から完全長のcDNAを分与頂いた。これらを大腸菌用の発現ベクター(pBAD plasmid)に繋ぎ、大腸菌内で高発現させた。これらの遺伝子はC3末端にHis Tagが位置するようになっていたので、発現した蛋白質は抗His-Tag抗体で検出できる。この検出システムで、確かに目的蛋白質が各々の形質転換体で生産されているかを検討した。その結果、37〜40kDの大きさのHig Tagを持つと思われる蛋白質を確認できた。この蛋白質を含む画分を用いてゲルシフトアッセイを行い、各々の蛋白質がAtGST11遺伝子のプロモーター領域(p-AtGST11)と結合することを確認した。現在、これらの蛋白質の精製法を検討中である。
4.新規の転写調節因子の単離
Yeast one hybrid法で、AtGST1と11遺伝子の両方について新規の転写調飾因子の単離を行い、塩基配列を決定した。その中にも4個の新たな転写調節因子が含まれていた。
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