分泌型ホスホリパーゼA_2の新規に生理機能の発見とその分子機構の解析

• 研究課題/領域番号: 16580054
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用微生物学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 有岡 学 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (20242159)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 2005年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: 分泌型ホスホリパーゼA_2 / 神経栄養因子 / L型カルシウムチャネル / アポトーシス / PC12 / 小脳顆粒細胞 / 神経突起伸長 / 麹菌 / 神経突起伸張

研究概要

sPLA_2およびLPCのシグナル伝達においてG2Aが関与するかどうかを検討するため、PC12細胞において内因的に発現しているG2AをRNA interference法によって発現抑制する実験を行った。ラットG2Aに特異的な配列をU6snRNA遺伝子のプロモーターを持つpmU6proベクターに挿入したのち、アデノウイルス発現ベクターpAxcwitに挿入し、目的のアデノウイルス(r2-Ad)を得た。r2-AdをPC12細胞に感染させたところ、内因的なG2Aの発現が抑制されることがRT-PCRにより明らかになった。さらに、r2-Adの感染は糸状菌sPLA_2、LPC、ヒトグループXsPLA_2によるPC12細胞の突起伸長を抑制した。以上の結果より、LPCの遊離を介したsPLA_2の神経栄養因子様作用にG2Aの活性化が関与することが強く示唆された。
一方、麹菌がそのゲノム配列中に持つ2つのsPLA_2遺伝子spaA、spaBの解析を行った。組換えタンパク質を用いて活性測定を行った結果、SpaAは10mMCa^<2+>、pH4-5、SpaBは1mMCa^<2+>、pH7-8に至適条件を持つことがわかった。それぞれに対する抗体を作製し、局在解析を行ったところ、SpaAは大部分が培地中に分泌されるのに対し、SpaBは菌体画分に存在することがわかった。間接蛍光抗体法による観察では、SpaAは細胞壁に局在したが、SpaBは小胞体様の網目状構造、またはlipid bodyに似た粒状の構造体に局在することが分かった。以上の結果から、SpaA、SpaBは単に重複して存在するのではなく、独立した機能を持つことが強く示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Visualization of the endocytic pathway in the filamentous fungus Aspergillus oryzae using an EGFP-fused plasma membrane protein. (2006)
  • 著者名/発表者名: Higuchi, Y., et al.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 340・3 ページ: 784-791
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Vacuolar membrane dynamics in the filamentous fungus Aspergillus oryzae. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shoji, J.Y., et al.
  • 雑誌名: Eukaryot. Cell 5・2 ページ: 411-421
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Visualization of the endocytic pathway in the filamentous fungus Aspergillus oryzae using an EGFP-fused plasma membrane protein. (2006)
  • 著者名/発表者名: Higuchi, Y., Nakahama, T., Shoji, J.Y., Arioka, M., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 340(3) ページ: 784-791
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Vacuolar membrane dynamics in the filamentous fungus Aspergillus oryzae. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shoji, J.Y., Arioka, M., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: Eukaryot.Cell 5(2) ページ: 411-421
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] SspA, an outer membrane protein, is highly induced under salt-stressed conditions and is essential for growth under salt-stressed aerobic conditions in Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsuzuki, M., et al.
  • 雑誌名: Appl. Microbiol. Biotechnol. 68・2 ページ: 242-250
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Development of Aspergillus oryzae thiA promoter as a tool for molecular biological studies. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shoji, J.Y., et al.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol. Lett. 244・1 ページ: 41-46
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Neuronal expression and neuritogenic action of group X secreted phospholipase A_2. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masuda, S., et al.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 280・24 ページ: 23203-23214
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A novel neurotrophic role of secretory phospholipases A_2 for cerebellar granule neurons. (2005)
  • 著者名/発表者名: Arioka, M., et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579・12 ページ: 2693-2701
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Secretory phospholipases A_2 induce neurite outgrowth in PC12 cells through lysophosphatidylcholine generation and activation of G2A receptor. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ikeno, Y., et al.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 280・30 ページ: 28044-28052
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Isolation and characterization of vacuolar protein sorting mutants from Aspergillus oryzae. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ohneda, M., et al.
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 71・8 ページ: 4856-4861
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 分泌型ホスホリパーゼA_2の神経栄養因子としての新規な作用 (2005)
  • 著者名/発表者名: 有岡 学
  • 雑誌名: バイオサイエンスとインダストリー 63・5 ページ: 297-302
  • NAID: 10015711811
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] SspA, an outer membrane protein, is highly induced under salt-stressed conditions and is essential for growth under salt-stressed aerobic conditions in Rhodobacter sphaeroides f.sp.denitrificans. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsuzuki, M., Xu, X., Sato, S., Abo, M., Arioka, M., Nakajima, H., Kitamoto, K., Okubo, A.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 68(2) ページ: 242-250
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Development of Aspergillus oryzae thiA promoter as a tool for molecular biological studies. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shoji, J.Y., Maruyama, J., Arioka, M., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol.Lett. 244(1) ページ: 41-46
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Neuronal expression and neuritogenic action of group X secreted phospholipase A_2. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masuda, S., Murakami, M., Takanezawa, Y., Aoki, J., Arai, H., Ishikawa, Y., Ishii, T., Arioka, M., Kudo, I.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(24) ページ: 23203-23214
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A novel neurotrophic role of secretory phospholipases A_2 for cerebellar granule neurons. (2005)
  • 著者名/発表者名: Arioka, M., Ikeno, Y., Cheon, S.-h., Nakashima, S., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579(12) ページ: 2693-2701
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Secretory phospholipases A_2 induce neurite outgrowth in PC12 cells through lysophosphatidylcholine generation and activation of G2A receptor. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ikeno, Y., Konno, N., Cheon, S.-h., Bolchi, A., Ottonello, S., Kitamoto, K., Arioka, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(30) ページ: 28044-28052
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Isolation and characterization of vacuolar protein sorting mutants from Aspergillus oryzae. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: Appl.Environ.Microbiol. 71(8) ページ: 4856-4861
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Novel neurotrophic effects of secretory phospholipase A_2. (2005)
  • 著者名/発表者名: Arioka, M.
  • 雑誌名: Bioscience and Industry (review in Japanese) 63(5) ページ: 297-302
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Neuronal expression and neuritogenic action of group X secreted phospholipase A_2 (2005)
  • 著者名/発表者名: Masuda et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(24) ページ: 23203-23214
• [雑誌論文] A novel neurotrophic role of secretory phospholipases A_2 for cerebellar granule neurons (2005)
  • 著者名/発表者名: Arioka et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579(12) ページ: 2693-2701
• [雑誌論文] Secretory phospholipases A_2 induce neurite outgrowth in PC12 cells through lysophosphatidylcholine generation and activation of G2A receptor (2005)
  • 著者名/発表者名: Ikeno et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(30) ページ: 28044-28052
• [雑誌論文] 分泌型ホスホリパーゼA_2の神経栄養因子としての新規な作用 (2005)
  • 著者名/発表者名: 有岡 学
  • 雑誌名: バイオサイエンスとインダストリー 63(5) ページ: 297-302
  • NAID: 10015711811
• [雑誌論文] SspA an outer membrane protein, is highly induced under salt-stressed conditions and is essential for growth under salt-stressed aerobic conditions in Rhodobacter sphaeroides f.sp.denitrificans. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsuzuki, M., et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. (発表予定)
• [雑誌論文] Development of Aspergillus oryzae thiA promoter as a tool for molecular biological studies. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shoji, J., et al.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol.Lett. 244・1 ページ: 41-46
• [雑誌論文] Isolation and characterization of vacuolar protein sorting mutants from Aspergillus oryzae. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ohneda, M., et al.
  • 雑誌名: Appl.Environ.Microbiol. (発表予定)
• [雑誌論文] Dibasic amino acid residues at the carboxy-terminal end of kinase homology domain participate in the plasma membrane localization and function of phosphatidylinositol 5-kinase γ. (2004)
  • 著者名/発表者名: Arioka, M., et al.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 319・2 ページ: 456-463
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The catalytic activity, but not receptor binding, of sPLA_2s plays a critical role for neurite outgrowth induction in PC12 cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakashima, S., et al.
  • 雑誌名: Brain Res. 1015・1-2 ページ: 207-211
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Development of a novel quadruple auxotrophic host transformation system by argB gene disruption using adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillus oryzae. (2004)
  • 著者名/発表者名: Jin, F.J., et al.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol. Lett. 239・1 ページ: 79-85
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Dibasic amino acid residues at the carboxy-terminal end of kinase homology domain participate in the plasma membrane localization and function of phosphatidylinositol 5-kinase γ. (2004)
  • 著者名/発表者名: Arioka, M., Nakashima, S., Shibasaki, Y., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 319(2) ページ: 456-463
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The catalytic activity, but not receptor binding, of sPIA_2s plays a critical role for neurite outgrowth induction in PC12 cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakashima, S., Kitamoto, K., Arioka, M.
  • 雑誌名: Brain Res. 1015(1-2) ページ: 207-211
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Development of a novel quadruple auxotrophic host transformation system by argB gene disruption using adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillus oryzae. (2004)
  • 著者名/発表者名: Jin, F.J., Maruyama, J., Juvvadi, P.R., Arioka, M., Kitamoto, K.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol.Lett. 239(1) ページ: 79-85
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Dibasic amino acid residues at the carboxy-terminal end of kinase homology domain participate in the plasma membrane localization and function of phosphatidylinositol 5-kinase γ. (2004)
  • 著者名/発表者名: Arioka, M., et al.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 319・2 ページ: 456-463
• [雑誌論文] Development of a novel quadruple auxotrophic host transformation system by argB gene disruption using adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillus oryzae. (2004)
  • 著者名/発表者名: Jin, F.J., et al.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol.Lett. 239・1 ページ: 79-85