超安定化酵素の創製-その極立った構造可逆性のメカニズム

• 研究課題/領域番号: 16580280
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用分子細胞生物学
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 徳永 正雄 鹿児島大学, 農学部, 教授 (20112782)
• 研究分担者: 石橋 松二郎 鹿児島大学, 農学部, 准教授 (20305163)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2007
• 研究課題ステータス: 完了 (2007年度)
• 配分額: 3,950千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 150千円); 2007年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円); 2006年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2005年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: 好塩性酵素 / 好塩菌 / nucleoside diphosphate kinase / キメラタンパク質 / 可溶性 / 好塩性 / 酸性アミノ酸 / 変異 / サブユニット / 蛋白質 / 高次構造形成 / フォールディング / キメラ蛋白質

研究概要

本研究における主な成果は、以下の通りである。
(1)高度好塩菌Halobacterium salinarum由来のnucloeoside diphosphate kinaseを大腸菌で活性のある形で発現させることに成功し、X-線結晶構造解析に成功したこと。その結果、多くの酸性アミノ酸の過剰な存在にもかかわらず、ポリペプチドの主鎖の構造は、他の生物のものとほとんど違いがなく、酸性アミノ酸側鎖を極めて巧妙に配置していることが判明した。
(2)中度好塩菌からHaNDK遺伝子を分離し、ホモログである通常細菌由来PaNDKとともに、大腸菌での大量発現に成功し、その性質を比較検討した。特に、HaNDKは、これまで研究されてきたNDKでは初めて2量体構造を取っていることが分かった。
(3)HaNDKとPaNDKのキメラ分子の構築と発現、精製、性質検討に成功し、PaNDKに、高い巻き戻り効率とSDS電気泳動での移動度の遅さという2つの好塩性酵素の指標を付与することができた。また、好塩性酵素の好塩性の指標は次の4点に集約される。(1)至適反応塩濃度が、より高い。(2)安定性は、塩の存在によって促進される。(3)高い可溶性からくる変性耐性、すなわち、高い巻き戻り活性をもつ。(4)そして、酸性アミノ酸含量が高いことに起因するSDS電気泳動での異常に遅い移動度。

研究成果

• [雑誌論文] Residue 134 detrmines the dimer-tetramer assembly of nucleoside diphosphate kinase from moderately halophilic bacteria (2008)
  • 著者名/発表者名: Tokunaga H., Ishibashi, M., Arisaka, F., Arai, S., Kuroki, R., Arakawa, T., Tokunaga, M.
  • 雑誌名: FEBS Lett 582 ページ: 1049-1054
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dimeric structure of nucleoside diphosphate kinase from moderately halophhilic bacterium:contrast to the tetrameric Pseudomonas counterpart (2007)
  • 著者名/発表者名: Y.Yonezawa, K.Izutsu, H.Tokunaga, K.Maeda, T.Arakawa, and M.Tokunaga
  • 雑誌名: FEMS Microbiol.Lett. 268 ページ: 52-58
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dimeric structure of nucleoside diphosphate kinase from moderately halophilic bacterium : contrast to the tetrameric Pseudomonas counterpart (2007)
  • 著者名/発表者名: Y. Yonezawa, K. Izutsu, H. Tokunaga, H. Maeda, T. Arakawa, M. Tokunaga
  • 雑誌名: FEMS Microbiol. Lett 268 ページ: 52-58
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Contribution of halophilic nucleoside diphosphate kinase from Halomonas sp.593 to the heat stability of chimeric molecule (2006)
  • 著者名/発表者名: H.Tokunaga, Y.Oda, Y.Yonezawa, T.Arakawa, and M.Tokunaga, 525-530(2006)
  • 雑誌名: ProteinPept.Lett. 13 ページ: 525-530
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Contribution of halophilic nucleoside diphosphate kinase from Halomonas sp. 593 to the heat stability of chimeric molecule (2006)
  • 著者名/発表者名: H. Tokunaga, Y. Oda, Y. Yonezawa, T. Arakawa, M. Tokunaga
  • 雑誌名: Protein Pept. Lett 13 ページ: 525-530
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Contribution of Halophilic Nucleoside Diphosphate Kinase Sequence to the Heat Stability of Chimeric Molecule (2006)
  • 著者名/発表者名: H.Tokunaga et al.
  • 雑誌名: Protein ＆ Peptide Letters 13 ページ: 525-530
• [雑誌論文] Structure of a halophilic nucleoside diphosphate kinase from Halobacterium salinarum (2005)
  • 著者名/発表者名: H.Besir, K.Zeth, A.Bracher, U.Heider, M.Ishibashi, M.Tokunaga, D.Oesterhelt
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579 ページ: 6595-6600
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of a halophilic nucleoside diphosphate kinase from Halobacterium salinarum (2005)
  • 著者名/発表者名: H. Besir, K. Zeth, A. Bracher, U. Heider, M. Ishibashi, M. Tokunaga, D. Oesterhelt
  • 雑誌名: FEBS Lett 579 ページ: 6595-6600
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] 高い構造可逆性と新規二量体構造を示した中度好塩性細菌由来nucleoside diphosphate kinase (2008)
  • 著者名/発表者名: 米澤悌、徳永廣子、前田浩貴、石橋松二郎、徳永正雄
  • 学会等名: 日本農芸化学会
  • 発表場所: 名城大学
  • 年月日: 2008-03-27
• [学会発表] Electrostatic and hydrophobic interactions play a major role in the stability and refolding of halophilic proteins (2005)
  • 著者名/発表者名: Masao Tokunaga, Matsujiro Ishibashi, Hiroko Tokunaga, and Tsutomu Arakawa
  • 学会等名: International Symposium on Extremophiles and Their Applications
  • 発表場所: Tokyo
  • 年月日: 2005-11-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] 融合タンパク質発現ベクター (2005)
  • 発明者名: 徳永 正雄 他
  • 権利者名: 鹿児島大学
  • 産業財産権番号: 2005-047809
  • 出願年月日: 2005-02-23