| 研究概要 |
本研究は、培養細胞の系を利用してヘパラン硫酸/ヘパリンの生合成酵素の細胞内における集積化に関する基礎的知見の収得を目指し、生合成酵素の一つ脱N-アセチル化酵素/N-硫酸転移酵素を材料に、1)N末部位を利用した細胞内局在化機構、2)酵素ドメイン同士の相互作用の解明を目的とした。
まず、NDST各アイソザイムが誘導発現できるようなHEK293細胞を材料として、各NDSTアイソザイムの誘導発現とヘパラン硫酸の二糖組成との関連について解析を行った。その結果、NDST1, 2, 4の強制発現により、N-硫酸化された二糖の割合が増加し、N-硫酸化の昂進が観測される一方で、NDST3では大きな変化が見られなかった。この結果は、in vitroにおける酵素活性の結果と良く相関していた。
次に、NDSTのN末部分のアイソザイム間でのシャッフリングとそれらのヘパラン硫酸構造形成に対する影響を解析するために、NDST3及び4のN末部分とNDST1の酵素活性領域を連結した融合蛋白のCHO-K1細胞での一過性発現を行った。その結果、コントロールに比べて、ヘパラン硫酸の二糖組成では顕著な変化が見られなかった。従って、この発現系では上記目的を検証することはできなかった。
さらに、NDSTの酵素ドメイン間の集積化に関する知見を得るため、非常に弱いN-硫酸転移活性を保持するNDST3が安定発現しているHEK293細胞にNDST4あるいは脱N-アセチル化酵素活性を変異により欠いたNDST1及び2それぞれの一過性発現を行った。その結果、コントロールに比べて、ヘパラン硫酸の二糖組成では顕著な変化が見られなかった。従って、この発現系では上記目的を検証することはできなかった。
最後に、NDST1の細胞質に露出していると推定される領域を含むポリペプチドを細胞質に限定して発現させることができた。
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